[發明專利]通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法

在審

• 申請號: 202010948773.8
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN112185465A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 孫雯;陳瑤;王華
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學附屬口腔醫院
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B40/30;G16B25/10
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 趙艷

1.一種通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)通過冰凍切片技術獲得不同牙周炎患者及正常對照的牙周組織切片，

(2)通過空間轉錄組技術對每個組織樣本進行測序，得到空間轉錄組數據；

(3)根據所述空間轉錄組數據進行標準數據分析，對所有檢測到的牙周組織不同區域免疫微環境中的細胞種類構成進行分群、鑒定及有效定位，并對不同區域的原始基因的種類和表達情況進行進一步聚類與差異分析，以選出牙周炎免疫調控機制中的關鍵基因及相關分子信號通路。

2.如權利要求1所述的通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，其特征在于，在步驟(2)中，通過空間轉錄組技術對每個組織切片中被載玻片捕獲區域內的寡核苷酸鏈捕獲并標記唯一分子標識符UMI和特殊空間條形碼的mRNA進行測序，得到空間轉錄組數據。

3.如權利要求1所述的通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述根據所述空間轉錄組數據進行標準數據分析包括以下步驟：

對空間轉錄組數據采用Fastp軟件過濾獲得可直接用于后續分析的測序數據；

采用barcode處理算法，將過濾得到的統計測序數據中所包含的cell barcode信息及相對應的counts數進行統計，從而判斷測序樣本中實際檢測到的點陣數，獲得真實的空間轉錄組測序信息；

將測序數據中cellbarcode對應的reads比對到已知物種相對應的基因組，分析所測的未知序列與已知序列間的相似性與差異性，并獲得與之比對的bam文件；

將上述包含有基因組比對后各種信息的bam文件進行轉化，將文件中比對到同一基因上的單分子標簽進行合并，并去除其中重復的UMI序列，得到每個基因對應的UMI數量，進而統計得到每個空間點陣所檢測到的基因數，并在空間染色片中進行可視化展示。

4.如權利要求3所述的通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述對所有檢測到的牙周組織不同區域免疫微環境中的細胞種類構成進行分群、鑒定及有效定位包括以下步驟：

基于PCA算法，將空間測序數據進行降維處理，得到二維/低維信息，利用t-SNE算法和UMAP算法，將幾千個空間點陣中具有相似性的spot進行聚類，進而得到聚類亞群(cluster)，并在空間染色片中進行可視化展示；

通過對兩兩聚類簇間每個基因的log表達量進行Welcht-tests，得到top10的差異基因作為Marker基因候選，結合cellMarker數據庫中已被驗證過的Marker基因，最終鑒定出每個cluster的Marker基因。

5.如權利要求4所述的通過空間轉錄組技術分析牙周炎免疫微環境的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述對不同區域的原始基因的種類和表達情況進行進一步聚類與差異分析包括以下步驟：

借助clusterProfiler軟件包將上述聚類簇的Marker基因與cellMarker數據庫中的基因做富集分析，觀察特定聚類簇富集于何種細胞類型，進而完成對細胞類型的鑒定；

將上述通過富集分析所得到的各聚類簇中具有明顯差異表達的基因作為候選基因群，與各大數據庫結合分析；

通過Gene Ontology數據庫對候選基因的細胞組件、分子功能、生物過程進行分析；

利用KEGG數據庫對候選基因進行Pathway Analysis，觀察候選基因主要富集于哪些信號通路上；

將候選基因與DisGeNET數據庫進行結合，通過富集分析觀察候選基因與哪些疾病密切相關。