[發(fā)明專利]一種檢測果蔬中諾如病毒的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010947717.2
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN112080588B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白亞龍;周昌艷;張緒富;索玉娟;戴迎春;瞿洋;邵毅
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學院;南方醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種檢測果蔬中諾如病毒的方法，包括如下步驟：步驟1、將果蔬樣品與洗脫緩沖液混合，收集上清液；步驟2、在所述上清液中加入磁性探針，捕獲所述上清液中的諾如病毒；步驟3、將結(jié)合諾如病毒的磁性探針加入到溶液中，加熱離心后取上清得到含有諾如病毒RNA的溶液，并進行RT?(q)PCR檢測。本發(fā)明提供的磁性探針可有效分離、富集果蔬中的微量諾如病毒，進而提高了諾如病毒的檢測靈敏度，相比于傳統(tǒng)的基于PEG(聚乙二醇)沉淀的檢測方法靈敏度提高3個數(shù)量級。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測果蔬中諾如病毒的方法。

背景技術(shù)

諾如病毒是引起人急性非細菌腸胃炎的主要病原體之一。近幾年來不論國內(nèi)還是國外都經(jīng)常爆發(fā)由諾如病毒引起的病例，尤其是在人員密集的學校、醫(yī)院、游輪等。根據(jù)美國CDC網(wǎng)站最新數(shù)據(jù)顯示(2020)，在世界范圍內(nèi)，每5例急性腸胃炎病中就有1例是因為諾如病毒引起的，每年由諾如病毒感染造成的急性腸胃炎病例約6.85億例，其中，5歲以下的兒童感染病例大約為2億例，其中約5萬兒童病例喪生，尤其是在發(fā)展中國家更是深受其害。

雖然目前的RT-(q)PCR是檢測諾如病毒的“金標準”，但是面對多種多樣的果蔬樣品，當直接使用RT-(q)PCR檢測方法檢測果蔬中的諾如病毒時，由于果蔬樣品中的諾如病毒含量過低，即使RT-(q)PCR有強大的擴增能力，也依然會導致RT-(q)PCR檢測方法無法精確的檢測諾如病毒。基于諾如病毒的低劑量致病性，如何對果蔬中的諾如病毒進行高效的分離和富集，提高諾如病毒檢測方法的靈敏度，受到了越來越多的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是目前諾如病毒檢測方法靈敏度低的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測果蔬中諾如病毒的方法，包括如下步驟：

步驟1、將果蔬樣品與洗脫緩沖液混合，收集上清液；

步驟2、在所述上清液中加入磁性探針，捕獲所述上清液中的諾如病毒；

步驟3、將結(jié)合諾如病毒的磁性探針加入到溶液中，加熱離心后取上清得到含有諾如病毒RNA的溶液，并進行RT-(q)PCR檢測；

其中，所述磁性探針包括羧基化硅包Fe₃O₄磁性粒子和豬胃粘膜蛋白，所述羧基化硅包Fe₃O₄磁性粒子和所述豬胃粘膜蛋白通過偶聯(lián)劑共價結(jié)合。

進一步地，步驟1中，所述洗脫緩沖液為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液，包括0.01-1％曲拉通、10-50U果膠酶、0.01-0.1mol/L甘氨酸，pH為8-11。

進一步地，步驟1中，將所述果蔬樣品和所述洗脫緩沖液混合20-60min。

進一步地，步驟2中，所述磁性探針通過包括如下步驟制備得到：

步驟2.1、將FeCl₃·6H₂O和FeSO₄·7H₂O溶解于去離子水中，在氮氣保護下加入氨水，制備得到Fe₃O₄磁性納米粒子；

步驟2.2、將環(huán)己烷、正己醇、曲拉通與水混合得到反相微乳液，并加入所述Fe₃O₄磁性納米粒子，隨后將氨水、TEOS依次加入到所述反相微乳液中，反應得到硅包Fe₃O₄磁性納米粒子；

步驟2.3、將所述硅包Fe₃O₄磁性納米粒子分散于甲苯中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮氣保護下反應得到氨基化硅包Fe₃O₄磁性納米粒子；