[發(fā)明專利]一種檢測HCV感染者血清中抗跨膜蛋白抗體微孔板、化學(xué)發(fā)光試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010946293.8
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN112255413A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 成軍;戴玉柱;陳鴻斌;楊春利;夏挺;閻利;斯友良;陳彧;劉瑋曄;王童;江曉肖;車飛虎;周華君
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九0三醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/569;G01N33/576;G01N33/58;G01N33/543;G01N21/76;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/51;C07K14/18;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22
• 代理公司: 浙江杭知橋律師事務(wù)所 33256
• 代理人: 廖靜

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種檢測HCV感染者血清中抗跨膜蛋白(抗P7)抗體的化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括由重組的HCV P7蛋白抗原包被得到的微孔板和分別獨(dú)立包裝的樣本稀釋液、陰性對照、陽性對照、酶標(biāo)記物工作液、底物液A、底物液B及洗液，底物液A包括魯米諾、鄰苯基苯酚、4?咪唑苯酚及碳酸緩沖液(CB)；底物液B包括過氧化脲與磷酸緩沖液(PB)；該試劑盒對HCV感染者血清中的抗P7抗體進(jìn)行體外定性/定量測定，建立HCV感染者血清中抗P7抗體的檢測技術(shù)并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，該試劑盒可應(yīng)用于丙型病毒性肝炎的篩查診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后評估、疾病機(jī)理和流行病學(xué)研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析定性/定量試劑盒，具體涉及一種應(yīng)用重組的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)跨膜蛋白(P7)抗原包被微孔板，檢測生成的包被抗原-待測抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，對HCV感染者血清中的抗P7抗體進(jìn)行體外定性/定量測定，建立HCV感染者血清中抗P7抗體的檢測技術(shù)并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，該試劑盒可應(yīng)用于丙型病毒性肝炎的篩查診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后評估、疾病機(jī)理和流行病學(xué)研究。

背景技術(shù)

1974年Golafield M首先報(bào)告輸血后非甲非乙型肝炎，1989年Choo QL，Weiner AJ等在Houghton M領(lǐng)導(dǎo)下利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆出了非甲非乙型肝炎的主要病原體隨后被命名為丙型肝炎病毒(HCV)的基因序列，由此引起的疾病稱為丙型肝炎(Hepatitis C)?，F(xiàn)已證實(shí)丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播的疾病，50-85％感染者成為慢性感染，并可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，10-30％患者可發(fā)展為肝硬化，其中肝細(xì)胞癌(HCC)年發(fā)生率約1-7％，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問題。2014年世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)表明：全世界大約超過1.85億人感染了HCV，其中感染率以東亞(3.8％)、中亞(3.7％)、北非/中東(3.6％)、南亞(3.4％)及東歐(2.9％)為最高，每年全球約35萬人死于與丙肝有關(guān)的疾病。我國丙型肝炎每年發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢，中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)公布的歷年“全國法定傳染病疫情情況”資料顯示：從2007年發(fā)病人數(shù)不足9.2萬上升到2014年的20.3萬；據(jù)此推算國內(nèi)大約有4000萬HCV感染者，各省市感染率不盡相同，平均感染率約為3.2％，是HCV感染的高流行區(qū)。隨著HCV感染治療進(jìn)入泛基因時(shí)代，重組蛋白酶抑制劑的直接使用(Direct Acting Antiviral，DAA)可大大提高患者實(shí)現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的比例(95％)，有望改變HCV感染威脅的嚴(yán)峻局面，但目前DAA治療尚面臨著諸多有待解決的問題：(1)“邊緣人群”無法接受有效治療，如注射毒品者、服刑人員以及男同性戀等，加劇了疾病的流行；(2)經(jīng)規(guī)范化DAA治療后，仍有部分患者未出現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答或治療失敗，且DAA治療并不能防止HCV再次感染；(3)醫(yī)保支付比例低、治療費(fèi)用昂貴，患者每療程治療費(fèi)用在數(shù)萬元-數(shù)十萬元人民幣。由此可知，慢性HCV感染在未來很長一段時(shí)間內(nèi)依舊是人類健康和全球公共衛(wèi)生安全的重大威脅。

HCV屬于黃病毒科，病毒體呈球形，基因組為單股正鏈RNA，全長約9.6kb，有7個(gè)基因型(1-7)和67個(gè)基因亞型，在我國以1b和2a基因型常見，HCV基因組由兩端的5'非編碼區(qū)(5'-NCR)、3'非編碼區(qū)(3'-NCR)和中間的一個(gè)開放讀碼框(ORF)組成，ORF與5'-NCR下游緊鄰，其基因組排列順序?yàn)?'-C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能編碼一個(gè)由3010～3030個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白前體，如圖1所示，在宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶和病毒自身蛋白酶的作用下，裂解產(chǎn)生10種HCV蛋白，如圖2所示，包括：3種結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白(Core)、包膜糖蛋白(E1，E2)、跨膜蛋白(P7)；6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。Core、E1、E2、P7共同組裝成完整的病毒顆粒，非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的生活周期中發(fā)揮重要作用。