[發明專利]利用微衛星標記鑒定東北黑熊親緣關系的方法

在審

• 申請號: 202010945822.2
• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN111926091A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 高建偉
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;G16B20/40;G16B40/00
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陳新勝

本發明公開了一種利用微衛星標記鑒定東北黑熊親緣關系的方法，所述方法利用NCBI中登錄的黑熊15對具有多態性的微衛星標記進行親權鑒定的研究，以建立一套靈敏、有效的適合東北黑熊親子鑒定的微衛星標記系統，為今后的圈養種群的繁殖管理提供一定的理論依據。本發明中15個微衛星位點PIC值在0.4218～0.7690之間，平均PIC值為0.5735，呈中度多態性標記的有4個，高度多態性標記的有11個，平均等位基因數是7.40個。應用微衛星位點進行親子鑒定時，其等位基因數至少為4個，本發明的結果高于此要求，此結果可信。本發明的結果所顯示的微衛星位點的多態性高，在一定程度上增加了其適用的地域范圍和種群范圍。

技術領域

本發明屬于動物遺傳育種與繁殖技術領域，涉及一種利用微衛星標記進行東北黑熊親緣關系鑒定的方法。

背景技術

微衛星親子鑒定是一個新興發展起來的分子標記親子鑒定技術。與其它子鑒定方法相比較，微衛星DNA標記有雜合度高、多態性好等優點，而且該方法在樣品采集和統一檢測標準方面更為方便，血液、組織、毛發以及福馬林保存樣品等均是很好的原材料，同時檢測不受年齡和環境等因素的影響。在親子鑒定中比其它方法有更高的準確性，特別在法醫學領域中用于個體識別和親子鑒定時，被認為是準確性最好的一種檢測方法。目前，微衛星親子鑒定在法醫學鑒定、家畜系譜鑒定和瀕危動物種群的系譜鑒定中應用非常廣泛。

養熊場內由于飼養員工作疏忽，造成子代系譜號碼出現混亂，對黑熊繁殖計劃的制定造成了影響。

發明內容

為了準確掌握黑熊的親緣關系，本發明提供了一種利用微衛星標記鑒定東北黑熊親緣關系的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種利用微衛星標記鑒定東北黑熊親緣關系的方法，包括如下步驟：

步驟一、以東北黑熊為研究對象，采用15個微衛星位點對東北黑熊進行多態性分析，其中：15個微衛星位點分別為ABB1、ABB3、ABB4、ABB5、ABB6、ABB7、ABB10、ABB11、ABB12、MSUT2、MSUT4、UT3、UT35、UT36和UT38；15個熒光基團修飾的微衛星標記引物進行基因分型的PCR擴增系統，具體如表1所示；

步驟二、采用QIAamp DNA Investigator試劑盒方法提取黑熊毛發基因組DNA，作為模板待用；PCR擴增反應體系為25L：2.5mM dNTPs 2L，buffer 2L，F-primer 1L，R-primer1L，Template 2L，rTaq 0.25L，超純水14.75～15.75L，Mg²⁺0.5～2L；PCR擴增反應程序為：95℃預變性5min；(94℃變性30s，不同溫度退火30s，72℃延伸30s)共30個循環，72℃延伸10min；4℃保存；PCR產物采用經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測依據DL 2000Marker來判斷是否為目標產物，如果不是目標產物，則首先合成每個位點的非熒光引物，進行PCR反應條件的優化和篩選，獲得的PCR產物經12％聚丙烯酰胺凝膠電泳進行多態性分析，將PCR產物較好并具有良好多態性的微衛星位點的引物上游5’端加入熒光標記，并合成熒光引物，應用合成的熒光引物進行樣本大量的PCR擴增，產物送上海生工進行測序，產物采用ABI3730Genetic Analyze檢測多態性；如果是目標產物，則采用12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，20bp Ladder marker用作DNA分子量標記，采用銀染觀察擴增產物的遷徙情況，判斷子代與父本、母本基因型分布；

步驟三、將15個微衛星引物上游5’端進行熒光標記，PCR產物在ABI PRISM 3730基因分析儀上進行分型，采用毛細管電泳方法進行等位基因分析，電泳數據通過GeneScan3.7和GenoTyper3.7轉換成等位基因的片段大小，并自動識別等位基因，使用GeneScan-500[ROX]作為內參，等位基因長度直接從GenoTyper3.7導入Excel表中進行片段大小的分級排序，按照David的方法進行等位基因和基因型的判讀；