[發(fā)明專利]鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2020-09-10
• 公開（公告）號: CN112062819A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管慶豐;楊慧;韓謙;張海文;廖承紅;趙建國;王金花;劉又銘
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/70;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 蘇州中合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

本發(fā)明涉及鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。培養(yǎng)大腸桿菌菌株并提取其DNA，設(shè)計(jì)大腸桿菌外膜蛋白表面抗原區(qū)域(21～274aa)基因序列的引物對，以鴨疫里默氏桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物和載體pET?28a(+)連接并轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，采取IPTG誘導(dǎo)的方法，誘導(dǎo)大腸桿菌外膜蛋白rBamD表達(dá)。經(jīng)過純化最終得到重組的大腸桿菌外膜蛋白rBamD。該重組外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性，能夠有效抵抗鴨疫里默氏桿菌病的感染，以及鴨疫里默氏桿菌所引起的疾病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程和基因工程領(lǐng)域，尤其涉及鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)，RA系革蘭氏陰性短桿菌，無鞭毛及芽孢，不運(yùn)動，可產(chǎn)生莢膜，可感染家鴨、鵝、火雞、雉雞等，是目前危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要病原菌，廣泛分布于世界各地的養(yǎng)鴨場，且感染后較難清除。RA感染途徑多為呼吸道感染和皮膚傷口(特別是腳部皮膚)感染，引起一種急性或慢性敗血性細(xì)菌性傳染病，典型病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等。該病的感染率有時可高達(dá)90％以上，但由于各血清型之間的毒力存在較大差異，所以死亡率為5％～75％不等，急性型表現(xiàn)為急性敗血癥死亡，慢性型一般無明顯癥狀，有些可表現(xiàn)為減重、產(chǎn)蛋量下降等。該病病死率最高可達(dá)90％，對水禽養(yǎng)殖業(yè)，尤其鴨和鵝的養(yǎng)殖造成重大損失。

隨著抗生素的長期大量使用，大大加速了致病菌耐抗藥性的進(jìn)化。越來越多的耐藥性菌株不斷出現(xiàn)。研究表明，鴨疫里默氏桿菌基因組中抗藥性基因的比重現(xiàn)在已大量增加，且多重耐藥現(xiàn)象極其嚴(yán)重，目前已陷入抗生素大量使用-病原菌耐藥性增強(qiáng)-加大使用抗生素-耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)的惡性循環(huán)中。同時，抗生素大量使用導(dǎo)致的抗生素殘留問題也日益嚴(yán)重。抗生素濫用引起的耐藥性問題及抗生素殘留問題已經(jīng)是一個全球性亟需解決的問題，改善動物養(yǎng)殖條件，接種疫苗預(yù)防病原菌是減少抗生素使用的有效途徑。

RA具有多個血清型，目前已報到的有25個血清型，雖然部分疫苗對本血清型或本致病型菌株具有較好的免疫保護(hù)作用，但對其他菌株的交叉免疫保護(hù)作用較弱或者沒有。鴨疫里默氏桿菌病的爆發(fā)往往是多種RA共同作用的結(jié)果，這給RA的防治帶來很大的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明旨在提供鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優(yōu)選地，編碼上述鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了上述鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1)以鴨疫里默氏桿菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為：

BamD F-BamHⅠ：5′-GGATCCTACGACCTAGCAATGAAA-3′，

BamD R-NotⅠ：5′-GCGGCCGCCTGTTCTACTAACTTTTCT-3′；

2)將步驟1)獲得的PCR產(chǎn)物與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒并測序；

3)將步驟2)測序正確的質(zhì)粒與表達(dá)載體酶切連接，得重組原核表達(dá)質(zhì)粒；

4)將步驟3)提取的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)，得鴨疫里默氏桿菌BamD重組蛋白。

優(yōu)選地，步驟2)中，與克隆載體pMD-19T simple vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。