[發明專利]一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的引物及方法

有效

• 申請號: 202010941603.7
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN111926105B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 余方偉;王神云;張偉;李建斌;于利
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院;南京利華農業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的引物及方法，屬于分子生物學技術領域。本發明公開的一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的方法，包括提取蕓薹生鏈格孢基因組DNA；以基因組DNA為模板，利用引物進行LAMP擴增；LAMP產物檢測：在反應結束后，直接觀察反應液顏色變化；或者通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發明公開的一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的引物及方法，特異性強，靈敏度高；所用設備簡單、操作簡便、鑒定方便；且能實現快速、高效擴增。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，更具體的說是涉及一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的引物及方法。

背景技術

蕓薹生鏈格孢(Alternaria brassicicola)是引起結球甘藍真菌性黑斑病的病原(以下簡稱黑斑病)。黑斑病在結球甘藍整個生長期均可發生，可侵染結球甘藍的葉、葉球、莖和角果等組織，危害結球甘藍蔬菜生產。

雖然目前有關蕓薹生鏈格孢分子檢測已有報道，但是這些方法以傳統PCR和熒光定量PCR檢測為主，對專用設備依賴性大，不能滿足快速、便捷檢測的需求。環介導的核酸恒溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種新的分子生物學方法，該方法利用4-6條引物實現等溫條件下目標片段的快速擴增。LAMP反應劇烈，在大量生成大小不等的擴增產物的同時產生肉眼可見的白色沉淀-焦磷酸鎂，若在LAMP反應體系中加入金屬離子指示劑如羥基萘酚藍HNB時，在LAMP反應大量消耗Mg²⁺過程中，溶液逐漸變為天藍色。可視化的顯色反應極大簡化了LAMP擴增產物的檢測。

目前LAMP技術的報道多見于衛生安全檢測、疾病診斷及環境安全檢測等方面，但是在植物病原真菌檢測方面，LAMP技術的應用還有待進一步擴展，未發現有LAMP法檢測蕓薹生鏈格孢的報道。

因此，提供一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的引物及方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的引物及方法，特異性強，靈敏度高。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的引物，所述引物序列如下：

F3：5’-ACAGGTTCGATTTCCGCAA-3’；SEQ ID NO.1；

B3：5’-TCTCCGGGTTGTGCATGT-3’；SEQ ID NO.2；

FIP：5’-CGATGACCAGGAGGGTGGGATTATGGCCTTGGTCCCGATAG-3’；SEQ ID NO.3；

BIP：5’-CTCGTGGTCCCAAAGGAAAGGACGTAGATGAAGTCGTCGCC-3’；SEQ ID NO.4；

LF1：5’-CACTACCACCAGATCTTTTACCTC-3’；SEQ ID NO.5；

LB1：5’-AGTTTATGACACGGACGAGGA-3’；SEQ ID NO.6。

進一步，一種LAMP檢測蕓薹生鏈格孢的方法，具體步驟如下：

(1)提取蕓薹生鏈格孢基因組DNA；蕓薹生鏈格孢接種在PDA培養基(BD公司)上，于25℃培養7d后，用滅菌牙簽刮取菌絲，置于液氮中充分研磨，用真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取；

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，利用上述引物進行LAMP擴增；