[發(fā)明專利]一種基于電轉(zhuǎn)制備NK樣細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010941196.X
• 申請(qǐng)日: 2020-09-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112048480A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 湯朝陽(yáng);秦樂(lè);吳迪;魏志輝;王翠花;其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開(kāi)姓名
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東昭泰體內(nèi)生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種基于電轉(zhuǎn)制備NK樣細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：(1)采用抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的組合活化T細(xì)胞；(2)將靶向Bcl11b基因的RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)入活化的T細(xì)胞，得到所述NK樣細(xì)胞；其中，所述RNP復(fù)合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。本發(fā)明采用電轉(zhuǎn)化的方法將靶向Bcl11b基因的RNP復(fù)合物導(dǎo)入活化的T細(xì)胞，并在電轉(zhuǎn)RNP復(fù)合物之前對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行抗人CD3抗體和抗人CD28抗體活化，各條件相互配合，有利于高效制備得到具有殺傷作用的NK樣細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于電轉(zhuǎn)制備NK樣細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)細(xì)胞免疫療法在癌癥治療中展現(xiàn)出了巨大的潛力，被認(rèn)為是最有希望攻克癌癥的方法，其中，基于T細(xì)胞的免疫治療技術(shù)受到了廣泛關(guān)注，是目前的研究熱點(diǎn)。然而，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)極大地限制了T細(xì)胞免疫治療的應(yīng)用范圍。與MHC限制的T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不需要進(jìn)行HLA配型，因此可以作為異源性的現(xiàn)貨細(xì)胞藥品對(duì)病人進(jìn)行免疫治療，在臨床上具有重要的應(yīng)用前景。但是NK細(xì)胞面臨著無(wú)法持續(xù)增殖的問(wèn)題。

研究人員也在研究T細(xì)胞的激活分化機(jī)制，嘗試對(duì)其進(jìn)行基因改造，獲得具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的T細(xì)胞。Li等人將小鼠T細(xì)胞重編程成為NK樣細(xì)胞(induced T-to-naturalkiller cells，ITNK細(xì)胞)(Li,P.et al.Reprogramming of T cells to natural killer-like cells upon Bcl11b deletion.Science 329,85-89(2010).)，并于近年采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地將人T細(xì)胞重編程成為ITNK細(xì)胞。

將Cas9和gRNA導(dǎo)入原代T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯的方法，存在打靶效率低、細(xì)胞毒性高的問(wèn)題，獲得的重編程ITNK細(xì)胞純度低、活性低，無(wú)法直接應(yīng)用于免疫治療。

因此，有必要改進(jìn)CRISPR/Cas9體系導(dǎo)入原代T細(xì)胞的工藝，不僅降低基因編輯系統(tǒng)對(duì)原代T細(xì)胞的毒性，而且提高重編程效率，增強(qiáng)重編程ITNK細(xì)胞的腫瘤殺傷功能。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際需求，本發(fā)明提供了一種基于電轉(zhuǎn)制備NK樣細(xì)胞的方法，所述方法將具有基因編輯功能的RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)入激活的T細(xì)胞中，重編程效率高、細(xì)胞毒性低，得到高純度有效識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的重編程N(yùn)K樣細(xì)胞。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種基于電轉(zhuǎn)制備NK樣細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)采用抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的組合活化T細(xì)胞；

(2)將靶向Bcl11b基因的RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)入活化的T細(xì)胞，得到所述NK樣細(xì)胞；

其中，所述RNP復(fù)合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。

本發(fā)明中，將靶向Bcl11b基因的RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)入活化的T細(xì)胞，保證了基因編輯系統(tǒng)高效轉(zhuǎn)入原代T細(xì)胞中，細(xì)胞毒性低，實(shí)現(xiàn)了基于基因編輯系統(tǒng)的T細(xì)胞基因編輯；而在RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)之前對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行抗人CD3抗體和抗人CD28抗體活化，進(jìn)一步增強(qiáng)了RNP復(fù)合物的電轉(zhuǎn)效率和基因編輯效率，T細(xì)胞活化和RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)兩者相互配合，制備得到高純度的識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞的NK樣細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述T細(xì)胞來(lái)源于外周血和/或臍帶血。

優(yōu)選地，所述抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的摩爾比為(1～5):1，例如可以是1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。