[發(fā)明專利]一種基于電轉(zhuǎn)制備NK樣細(xì)胞的方法

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• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112048480A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 湯朝陽;秦樂;吳迪;魏志輝;王翠花;其他發(fā)明人請求不公開姓名
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東昭泰體內(nèi)生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種基于電轉(zhuǎn)制備NK樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)采用抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的組合活化T細(xì)胞；

(2)將靶向Bcl11b基因的RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)入活化的T細(xì)胞，得到所述NK樣細(xì)胞；

其中，所述RNP復(fù)合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述T細(xì)胞來源于外周血和/或臍帶血。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的摩爾比為(1～5):1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述T細(xì)胞活化3～6天后，將所述RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)入T細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述RNP復(fù)合物中crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白的摩爾比為1:(1～3):(1～3)；

優(yōu)選地，所述RNP復(fù)合物的濃度為40～120μM。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述crRNA包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

優(yōu)選地，所述tracrRNA包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述電轉(zhuǎn)的緩沖液為不含酚紅的OPTI-MEM^TM；

優(yōu)選地，所述電轉(zhuǎn)的電壓為800～2500V；

優(yōu)選地，所述電轉(zhuǎn)的時間為1～8ms；

優(yōu)選地，對于2mm電擊杯，所述電轉(zhuǎn)的電壓為1000～2000V，時間為1～4ms。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)制備靶向Bcl11b基因的RNP復(fù)合物，所述RNP復(fù)合物中crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白的摩爾比為1:(1～3):(1～3)，所述crRNA包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列，所述tracrRNA包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；

(2)從外周血和/或臍帶血中分離單個核細(xì)胞并分選得到T細(xì)胞，采用摩爾比為(1～5):1的抗人CD3抗體和抗人CD28抗體的組合活化T細(xì)胞；

(3)T細(xì)胞活化3～6天后，將濃度為40～120μM的RNP復(fù)合物在不含酚紅的OPTI-MEM^TM緩沖液條件下電轉(zhuǎn)入活化的T細(xì)胞，在2mm電擊杯中，所述電轉(zhuǎn)的電壓為1000～2000V，時間為1～4ms，得到所述NK樣細(xì)胞。

9.一種NK樣細(xì)胞，其特征在于，所述NK樣細(xì)胞采用權(quán)利要求1-8任一項所述的方法制備得到。

10.權(quán)利要求9所述的NK樣細(xì)胞在制備腫瘤免疫治療藥物中的應(yīng)用。