[發(fā)明專利]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對高氧暴露肺和腦損傷保護(hù)的動物模型

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010940706.1
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112048479A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林益平;丁明星;姚靜嬋
• 申請（專利權(quán)）人: 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/65;A01K67/027
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發(fā)明屬于科學(xué)、醫(yī)學(xué)或數(shù)學(xué)用的模型技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對高氧暴露肺和腦損傷保護(hù)的動物模型，在大鼠模型中使用持續(xù)高氧氣誘導(dǎo)肺和腦損傷，同時構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白標(biāo)記人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，采用氣管及鼻腔與靜脈移植，進(jìn)行UC?MSc定植與生長跟蹤與凋亡檢測，并行組織學(xué)評價、氧化應(yīng)激與炎癥因子檢測及功能評估。本發(fā)明利用攜帶GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染UC?MSc，采用氣管、鼻腔及尾靜脈注射UC?MSc的3種移植方法比較。進(jìn)行氣管、鼻腔及尾靜脈注射UC?MSc的移植，跟蹤其在肺和腦的定植情況，探索UC?MSc對SCI大鼠高氧肺和腦損傷的同時治療作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于科學(xué)、醫(yī)學(xué)或數(shù)學(xué)用的模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對高氧暴露肺和腦損傷保護(hù)的動物模型。

背景技術(shù)

目前，業(yè)內(nèi)常用的現(xiàn)有技術(shù)是這樣的：較高濃度和較長時間的持續(xù)氧療可導(dǎo)致急性肺損傷或支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)，BPD在全球發(fā)病率逐年增高，早產(chǎn)兒中BPD發(fā)生率為6％-57％，死亡率達(dá)20.8％。早產(chǎn)兒因多接受復(fù)蘇和呼吸管理，且其抗氧化防御機(jī)制不成熟，特別容易受到氧療毒性的影響，除了對肺的影響，高氧也導(dǎo)致發(fā)育中大腦的細(xì)胞死亡，導(dǎo)致運(yùn)動和認(rèn)知缺陷，對社會和家庭造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。臨床研究顯示BPD是早產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育滯后及腦癱的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，盡管類固醇可以減少BPD，但可能與長期不良神經(jīng)系統(tǒng)不良結(jié)果相關(guān)，或與新生兒死亡率增加有關(guān)，迄今無具體或有效的治療方法。因而，如何防治高氧肺和腦損傷導(dǎo)致的呼吸道和神經(jīng)功能障礙是新生兒重癥監(jiān)護(hù)領(lǐng)域研究的難點(diǎn)。干細(xì)胞治療有望成為針對復(fù)雜且多因素的難治性和破壞性新生兒疾病治療的新突破。早產(chǎn)兒中高氧肺和腦損傷之間的密切聯(lián)系提示表明肺保護(hù)療法也可能對早產(chǎn)兒具有神經(jīng)保護(hù)的協(xié)同作用。BPD的病因與高氧性肺損傷密切相關(guān)，在肺發(fā)育的關(guān)鍵時期，新生動物長時間高氧暴露可阻礙肺泡間隔形成，使肺泡數(shù)目減少、肺泡炎和肺血管損傷，表現(xiàn)為肺發(fā)育受阻現(xiàn)象，呈現(xiàn)正常肺生長“重編程”的特征，包括氣道高反應(yīng)性，肺功能檢查異常，以及在某些情況下持續(xù)到成年期的肺氣腫變化、繼發(fā)性肺動脈高壓等，增加死亡率，甚至發(fā)展成年慢性阻塞性肺疾病，具有終身后果。而高氧誘導(dǎo)的腦損傷主要發(fā)生在最脆弱的發(fā)展時期，即與人類孕齡相當(dāng)?shù)?3～32周，而成熟大鼠中P14的抗氧化酶可以保護(hù)新生大腦免受氧化和隨之的炎癥損傷。腦室周圍白質(zhì)軟化癥(periventricularleukomalacia,PVL)是臨床早產(chǎn)兒BPD基礎(chǔ)上的腦炎和氧化損傷的結(jié)果。嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡或繼發(fā)神經(jīng)功能障礙和腦癱，其具體機(jī)制同樣未明，推測可能由許多因素介導(dǎo)，包括衰老高氧損傷本身、炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡、分泌效應(yīng)和生長因子如VEGF等有關(guān)，長時間高氧可破壞血腦屏障，更易受到旁分泌的影響，甚至表現(xiàn)出發(fā)育及行為學(xué)的改變。尋求更好的治療策略來預(yù)防和治療BPD、PVL及相關(guān)并發(fā)癥，以保證兒童正常發(fā)育，顯得極為迫切。高氧可通過產(chǎn)生過量的氧自由基等途徑導(dǎo)致肺和腦等發(fā)育中的正常器官生長停止。最新的證據(jù)表明，正常細(xì)胞分化和組織修復(fù)所需的內(nèi)源性干細(xì)胞/祖細(xì)胞的喪失可能是這種損傷的病理生物學(xué)基礎(chǔ)。干細(xì)胞是可以經(jīng)歷自我更新并具有分化成多種細(xì)胞類型的潛力的原始細(xì)胞，對于正常發(fā)育以及維持正常生理學(xué)是至關(guān)重要的。基礎(chǔ)和臨床研究均支持循環(huán)和組織祖細(xì)胞的丟失可能是BPD與PVL等疾病的異常發(fā)育生長模式的機(jī)制所在。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cell,MSC)已在疾病臨床前模型和人類移植研究中得到廣泛的研究。他們有自我更新的能力，其后代有能力分化成各種細(xì)胞譜系，其來源包括骨髓、脂肪組織、臍帶血、胎盤等。高氧誘導(dǎo)的新生大鼠BDP模型中測試結(jié)果顯示，骨髓來源MSC能抑制炎癥，改善肺泡和肺血管損傷和相關(guān)性肺動脈高壓，而氣管內(nèi)移植臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cordmesenchymal stem cells,UC-MSc)僅在炎癥的早期階段有保護(hù)作用，也有人為其長期保護(hù)作用可持續(xù)100天。而在I期臨床試驗(yàn)中，也顯示早產(chǎn)兒中氣管插管同種異體人UCMSc是安全可行的，無遠(yuǎn)期不良反應(yīng)。同時，動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)骨髓來源MSC能在近似于室內(nèi)空氣控制環(huán)境下高氧受損的肺組織定植，恢復(fù)其結(jié)構(gòu)與功能。但有關(guān)MSC移植對高氧腦損傷的保護(hù)作用鮮見報(bào)道，盡管在創(chuàng)傷性腦損傷的大鼠模型已證實(shí)MSC空間學(xué)習(xí)改善和感覺運(yùn)動功能恢復(fù)的治療效果，未見新生兒腦損傷中使用MSC的臨床試驗(yàn)。氣管內(nèi)MSC移植是否具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用，尚未得到驗(yàn)證。MSC成功的移植方法迄今為止報(bào)告包括靜脈移植(IV)，氣管內(nèi)移植(IT)或腹膜腔移植(IP)，局部腦室內(nèi)及鼻內(nèi)(Intranasal,IN)移植等，都顯示出治療效果。盡管最佳移植途徑還有待確定，但最近的一項(xiàng)研究表明，使用新生大鼠高氧模型的IT移植顯得更為有效，而IVMSC注射對肺組織學(xué)或功能障礙沒有影響。目前MSC在機(jī)體內(nèi)的研究，絕大部分通過靜脈途徑，但靜脈注射移植的MSC不能穿過血腦屏障，而通過鼻腔或呼吸道黏膜吸收進(jìn)入血液循環(huán)，起效速度快，可避免首過消除，生物利用度完全，毒副作用一般較全身用藥小。向受傷腦傳遞MSC的最有效方法似乎是鼻內(nèi)途徑，大鼠中hWJ-MSC的鼻內(nèi)遞送阻止了早產(chǎn)大鼠腦中WMI模型的脫髓鞘和微膠質(zhì)細(xì)胞增生；小鼠模型中鼻內(nèi)給藥MSCs發(fā)現(xiàn)，治療的動物表現(xiàn)出顯著的感覺運(yùn)動和認(rèn)知功能的改善，且由MSC治療引起的保護(hù)作用持續(xù)終身，安全性好，未見鼻、腦或其他器官的全身病理損傷或瘤形成。因此，氣管內(nèi)或鼻腔MSC移植可能比MSC的全身靜脈途徑更有效，但經(jīng)氣管或鼻腔腔途徑進(jìn)入機(jī)體內(nèi)MSC的聚集、定植與分化情況，其進(jìn)入體內(nèi)后歸巢到肺部或腦部的機(jī)制及如何進(jìn)一步發(fā)揮損傷修復(fù)作用，移植的關(guān)鍵治療時間窗如何，尚需進(jìn)行深入研究。