[發(fā)明專利]一種代謝物蛋白互作檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010939416.5
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112051342A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何敬全;黃強(qiáng);范艷群;高廣東
• 申請（專利權(quán)）人: 上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 上海微策知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31333
• 代理人: 張靜

本發(fā)明屬于代謝物蛋白互作檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種代謝物蛋白互作檢測方法。本發(fā)明提供一種代謝物蛋白互作檢測方法，包括以下步驟：(1)總蛋白的提?。簭臉悠分腥?0～40ug總蛋白，進(jìn)行SDS?PAGE電泳；(2)代謝物與蛋白的孵育：固定代謝小分子與總蛋白共同孵育為實(shí)驗(yàn)組；以總蛋白孵育為對照組，將兩組分別進(jìn)行孵育；(3)蛋白的酶解：將孵育后的實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本進(jìn)行還原、烷基化以及胰酶酶解處理；(4)肽段收集和檢測：利用C18 column分別收集實(shí)驗(yàn)組和對照組的肽段，利用液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀對肽段進(jìn)行檢測分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及代謝物蛋白互作檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種代謝物蛋白互作檢測方法。

背景技術(shù)

內(nèi)源性代謝物小分子是胞內(nèi)分子化合物的主要成分，并且各種代謝物分子在胞內(nèi)濃度分布上具有較大差異。其所涉及的與多種多樣的蛋白質(zhì)的相互作用(無論是通過以產(chǎn)物/底物的形式參與酶促反應(yīng)過程，或是以變構(gòu)輔因子/配體的形式變構(gòu)調(diào)控蛋白質(zhì))，已被證明可以控制生化反應(yīng)中的物質(zhì)能量代謝并且能通過信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)整個生理過程。因此，解析闡述生理?xiàng)l件下的代謝物-蛋白質(zhì)相互作用能夠揭示隱藏在疾病/健康狀態(tài)下的分子理論基礎(chǔ)，對于人類健康與醫(yī)藥發(fā)展至關(guān)重要。此外，疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)劑還可能為潛在的治療干預(yù)措施提供新的策略。

盡管研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)量可觀的代謝物-蛋白質(zhì)相互作用，但基于代謝體系的復(fù)雜性以及缺乏有效的表征手段，只有其中的一小部分所涉及的相互作用網(wǎng)絡(luò)被研究透徹。常見的用以表征代謝物-蛋白質(zhì)相互作用的研究手段包括熒光光譜法、表面等離子體共振、等溫滴定量熱法、核磁共振法等，但大多數(shù)這樣的研究手段均需要在分析之前對蛋白質(zhì)/配體進(jìn)行標(biāo)記、蛋白質(zhì)固載或者其他額外的操作，故而可能產(chǎn)生假陽性的代謝物-蛋白質(zhì)互作研究結(jié)果。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，高分辨質(zhì)譜逐漸成為了代謝物-蛋白質(zhì)相互作用的新型研究平臺。Saghatelian等在體外異源表達(dá)了靶標(biāo)蛋白，利用代謝組學(xué)的手段篩選了與該蛋白可能具有相互作用的代謝物，但存在材料吸附過程中產(chǎn)生非特異性吸附從而引入假陽性結(jié)果的可能。

發(fā)明內(nèi)容

為了精確檢測英托利匹特中抗氧劑BHT的含量，本發(fā)明提供了一種代謝物蛋白互作檢測方法，包括以下步驟：

(1)總蛋白的提取：從樣品中取10～40mg總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；

(2)代謝物與蛋白的孵育：固定代謝小分子與總蛋白共同孵育為實(shí)驗(yàn)組；以總蛋白孵育為對照組，將兩組分別進(jìn)行孵育；

(3)蛋白的酶解：將孵育后的實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本進(jìn)行還原、烷基化以及胰酶酶解處理；

(4)肽段收集和檢測：利用C18 column分別收集實(shí)驗(yàn)組和對照組的肽段，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對肽段進(jìn)行檢測分析。

從樣品中取100～1000mg總蛋白，這里蛋白的質(zhì)量按照預(yù)先知曉的濃度計(jì)算得到，本領(lǐng)域常規(guī)采用BCA蛋白定量方法對樣品進(jìn)行總蛋白檢測得到總蛋白濃度，通過換算后得到總蛋白質(zhì)量進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述SDS-PAGE電泳過程為：向提取的總蛋白中取出10～40ug總蛋白樣本，向其中加入1～10*loading Buffer，金屬浴90～100℃變性5～20min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，電泳結(jié)束觀察蛋白完整性。

作為一種更優(yōu)選的技術(shù)方案，所述SDS-PAGE電泳過程為：向提取的總蛋白中取出20ug總蛋白樣本，向其中5*loading Buffer，金屬浴95℃變性10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，電泳結(jié)束觀察蛋白完整性；其中，Buffer：250mM Tris-HCl pH6.8；10％(w/v)SDS；0.5％(w/v)溴酚蘭；50％(v/v)甘油；5％(w/v)β-巰基乙醇。

作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述代謝小分子為ATP。