[發(fā)明專利]一種高光學純L-乳酸工程菌的構建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010936756.2
• 申請日: 2020-09-08
• 公開（公告）號: CN111849852A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設計）人: 田錫煒;張一凡;杭海峰;王永紅;儲炬;夏建業(yè);莊英萍
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;華東理工大學青島創(chuàng)新研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/113;C12N15/74;C12N15/90;C12R1/225
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

本發(fā)明涉及一種高光學純L?乳酸工程菌的構建方法，包括多個步驟，本發(fā)明選取擬干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei NCBIO01)作為出發(fā)菌株，參照其全基因組序列，基于CRISPR/Cas9基因編輯方法構建了pNcasA?△ldhD敲除質粒，無痕敲除D?乳酸脫氫酶(ldhD)的同時過表達一個L?乳酸脫氫酶基因(ldhL)，得到一株高光學純L?乳酸工程菌，使其L?乳酸光學純度從原來的95.6％提高到99％以上，并且生產速率達到5.5g/L/h以上，成為潛在的工業(yè)L?乳酸高效生產菌株。

技術領域

本發(fā)明涉及乳酸菌技術領域，具體涉及一株高光學純L-乳酸工程菌及其構建方法。

背景技術

乳酸作為一種多用途的天然有機酸，廣泛應用于食品、日用化工、制藥、紡織、環(huán)保和農業(yè)等諸多領域。乳酸的生產方法主要有微生物發(fā)酵法和化學合成法，微生物發(fā)酵生產乳酸具有成本低、光學純度高、操作容易、安全性高以及污染小等優(yōu)點，因此受到科研人員廣泛關注。近年來，人們通過L-乳酸聚合生成聚L-乳酸(poly lactic acid，PLA)，由于其生物相容性、可降解性以及無毒害作用等優(yōu)良性能，能實現(xiàn)在生物圈中循環(huán)，是一種非常理想的高分子材料，在工業(yè)上具有廣闊的應用前景。但是聚L乳酸的合成需要高光學純度的L-乳酸作為前體物質，大多數(shù)同型乳酸發(fā)酵乳酸生產菌株具有較高的乳酸生產能力，但是會伴隨著D-乳酸的生成，L-乳酸的光學純度達不到合成聚乳酸的級別，必須通過下游的分離純化步驟，加大了生產成本。

目前大部分乳酸生產菌株都是通過自然篩選和人工誘變獲得，然而這些乳酸生產菌株在發(fā)酵過程中都存在一些限制性因素，例如同時存在L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶，產生L-乳酸和D-乳酸的異構體混合物，或者是異型乳酸發(fā)酵，乳酸光學純度高，但副產物多，導致乳酸獲得率低。隨著分子生物學和基因組學、代謝組學的飛速發(fā)展，基因操作手段也越來越普及，人們可以通過對乳酸菌的定向基因編輯來獲得所需性狀的突變株。目前乳酸菌中應用最多的基因編輯方法是基于質粒的同源重組、單鏈DNA重組、Red/RecET介導的雙鏈DNA重組等，但這些方法都操作復雜、耗時耗力，限制了乳酸菌代謝工程的發(fā)展，迫切地需要更高效更簡便的方法。近年來，一種新型的基因編輯工具(CRISPR/Cas)，被成功應用到哺乳動物、植物及微生物中，極大了促進了功能基因組學及基因療法的發(fā)展。利用該方法可以對目標基因進行點突變、基因敲除及基因插入，并且能精準定位到基因組的目標位置。擬干酪乳桿菌是一株同型乳酸發(fā)酵生產L-乳酸的高產菌株，并且在發(fā)酵過程中不易受雜菌影響，操作簡單，擁有較高的工業(yè)應用前景。傳統(tǒng)基因編輯方法對擬干酪乳桿菌改造效率低下，其CRISPR基因編輯技術亦尚未有報道，若能成功開發(fā)將極大提高擬干酪乳桿菌基因組編輯效率，從而服務于高性能乳酸菌的遺傳改造，并擴展產物的應用前景。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一株高光學純L-乳酸工程菌的構建方法，其具有讓L-乳酸光學純度提高的優(yōu)點。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種高光學純L-乳酸工程菌的構建方法，包括如下步驟，

步驟1：制備PCR體系50μl，取PCR擴增產物，進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定成功后對PCR產物進行純化回收；

步驟2：根據(jù)擬干酪乳桿菌ldhD基因序列，在ldhD基因CDS區(qū)上游設計sgRNA,通過引物ldhDsg-F/ldhDsg-R PCR擴增得到sgRNA片段，以擬干酪乳桿菌基因組為模板，用引物ldhDup-F/ldhDup-R、ldhDdown-F/ldhDdown-R分別PCR擴增出ldhD上游同源臂和下游同源臂各1000bp，以ldhL-F/ldhL-R引物PCR擴增出L-乳酸脫氫酶基因(ldhL)，以pan7-1質粒為模板，以Amp-F/Amp-R引物PCR擴增出氨芐青霉素抗性基因片段，