[發(fā)明專利]一種高光學(xué)純L-乳酸工程菌的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010936756.2
• 申請日: 2020-09-08
• 公開（公告）號: CN111849852A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田錫煒;張一凡;杭海峰;王永紅;儲炬;夏建業(yè);莊英萍
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué);華東理工大學(xué)青島創(chuàng)新研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/113;C12N15/74;C12N15/90;C12R1/225
• 代理公司: 上海翼勝專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

1.一種高光學(xué)純L-乳酸工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述構(gòu)件方法包括：

步驟1：制備PCR體系50μl，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定成功后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收；

步驟2：根據(jù)擬干酪乳桿菌ldhD基因序列，在ldhD基因CDS區(qū)上游設(shè)計(jì)sgRNA,通過引物ldhDsg-F/ldhDsg-R PCR擴(kuò)增得到sgRNA片段，以擬干酪乳桿菌基因組為模板，用引物ldhDup-F/ldhDup-R、ldhDdown-F/ldhDdown-R分別PCR擴(kuò)增出ldhD上游同源臂和下游同源臂各1000bp，以ldhL-F/ldhL-R引物PCR擴(kuò)增出L-乳酸脫氫酶基因(ldhL)，以pan7-1質(zhì)粒為模板，以Amp-F/Amp-R引物PCR擴(kuò)增出氨芐青霉素抗性基因片段；

步驟3：再用PCR將氨芐青霉素抗性基因片段、上游同源臂、ldhL基因、下游同源臂以及sgRNA融合，引物設(shè)計(jì)時需要使融合的片段之間存在20-40bp的重復(fù)區(qū)，五個片段融合的摩爾比為1:3:5:3:1，得到構(gòu)建完成的質(zhì)粒pNcas-△ldhD；

步驟4：將保存好的Lactobacillus paracasei甘油管在一級MRS茄子瓶涂布活化，37℃培養(yǎng)36h，然后將一級MRS茄子瓶菌體轉(zhuǎn)接到二級茄子瓶中，37℃靜止培養(yǎng)18h，將二級茄子瓶中的菌體用50mL的無菌水洗滌，在MRS平板中劃線，37℃靜置培養(yǎng)36h，挑取單菌落接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃，110r/min過夜培養(yǎng)，按照5％的比例轉(zhuǎn)接至50mL含有1％濃度甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃,110r/min培養(yǎng)至OD620值為0.6，然后4500rpm，4℃離心10min收集菌體，電轉(zhuǎn)緩沖液洗兩遍，用1mL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體，按每管80μL分裝于1.5mL離心管中，凍存于-80℃，取100ng的pNcas-△ldhD質(zhì)粒，將其與感受態(tài)細(xì)胞充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的2mm電極杯中，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，快速加入37℃預(yù)熱的復(fù)蘇液MMRS，轉(zhuǎn)移至離心管中，37℃復(fù)蘇培養(yǎng)3h，涂布抗性平板，37℃培養(yǎng)48h，計(jì)算其轉(zhuǎn)化效率；

步驟5：用具有氨芐抗性的MRS平板篩選含有pNcas-△ldhD質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，然后挑取轉(zhuǎn)化子單菌落過夜復(fù)蘇培養(yǎng)，提取突變株基因組用ldhD特異性引物ldhD-F/ldhD-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，通過PCR，核酸電泳跑出來的膠圖和設(shè)計(jì)引物時的預(yù)期是一致的的轉(zhuǎn)化子提供基因組送去生工生物測序，并將測序結(jié)果與源基因組比對，檢驗(yàn)敲除結(jié)果，得到高光學(xué)純L-乳酸工程菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高光學(xué)純L-乳酸工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：還包括有步驟6：150μL甘油管保藏的擬干酪乳桿菌菌液，均勻涂布于茄子瓶斜面培養(yǎng)基中，在37℃條件下，持續(xù)36h，連續(xù)活化培養(yǎng)兩代，用50mL無菌水將活化菌株從茄子瓶斜面培養(yǎng)基中洗脫下來，之后接入15％v/v接種量的種子搖瓶培養(yǎng)基中，搖床在37℃，100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)12h左右，當(dāng)OD620＝10后再接入20％v/v接種量的發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，搖床在37℃，110r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48h。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高光學(xué)純L-乳酸工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：還包括有步驟7：建立HPLC的方法對發(fā)酵產(chǎn)物中L-乳酸和D-乳酸對映體進(jìn)行拆分，并檢測發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)中的比例，方法：采用手性柱phenomenx LC column色譜柱，流動相為0.002mol/L CuSO4·5H2O和5％異丙醇溶液，流速1mL/min，進(jìn)樣量5μL，檢測波長254nm，柱溫30℃，用化學(xué)純的L-乳酸和D-乳酸作為標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將樣品稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)進(jìn)行檢測。