[發明專利]一種高效生產1,3-丙二醇的基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010935797.X
• 申請日: 2020-09-08
• 公開（公告）號: CN111996157B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 馬春玲;王瑞明;李丕武;王艷霞
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P7/18;C12R1/22
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 劉文容

本發明涉及一種高效生產1,3?丙二醇的基因工程菌及其構建方法與應用。本發明在肺炎克雷伯氏菌中強化表達1,3?丙二醇氧化還原酶來增強1,3?丙二醇氧化還原酶的酶活，同時構建NADH再生途徑，以降低3?羥基丙醛的積累，強化3?羥基丙醛轉化為1,3?丙二醇，從而提高1,3?丙二醇的產量。本發明構建得到的基因工程菌1,3?丙二醇氧化還原酶的酶活是出發菌株的3.25?3.5倍；甲酸脫氫酶的酶活為0.414?0.45U/mg。采用本發明構建得到的基因工程菌進行分批補料發酵29h，1,3?丙二醇的產量比出發菌株提高了43.89％?97.93％，雙基因協同作用，顯著提高了1,3?丙二醇的產量和產率。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高效生產1,3-丙二醇的基因工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PD)是一種重要的化工原料，除了能夠作溶劑外，其主要作用是作為合成聚酯、聚氨酯的單體，以1,3-丙二醇和對苯二甲酸為單體合成的聚合物聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)是一種新型聚酯材料，具有易染色、彈性好、抗靜電、可降解、良好的柔軟性等特點，近年來也受到了人們的關注。1,3-丙二醇的生產方法有化學法和微生物發酵法兩種。隨著化石燃料資源的日益枯竭，基于石油資源的化學合成法受到嚴重限制，微生物發酵法生產1,3-丙二醇已經成為當前的研究熱點。

3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)是甘油代謝生產1,3-丙二醇的重要中間產物。在甘油轉化生產1,3-丙二醇的途徑中，甘油在甘油脫水酶(GNlyceroldehydratase,GDHt)的催化下脫水生成了3-HPA，3-HPA在消耗還原力NADH(還原型輔酶I)的基礎上，在1,3-丙二醇氧化還原酶(l,3-propanedioldehydroenase，PDOR)的催化下生成了1,3-丙二醇。而在利用肺炎克雷伯氏菌發酵法生產1,3-丙二醇的過程中，3-HPA的高濃度積累會對細胞的生長和代謝產物的合成產生嚴重的抑制作用，造成發酵過程非正常終止。

3-HPA的積累是由于3-HPA的產生和消耗速率不平衡造成的，發酵前期甘油脫水酶和1,3-丙二醇氧化還原酶的酶活不平衡也是造成3-HPA積累的關鍵因素，而還原力NADH的消耗和供應不足也會影響發酵途徑的正常進行和1,3-丙二醇的生產。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種高效生產1,3-丙二醇的基因工程菌及其構建方法與應用。本發明在肺炎克雷伯氏菌中強化表達1,3-丙二醇氧化還原酶來增強1,3-丙二醇氧化還原酶的酶活，同時構建NADH再生途徑，以降低3-羥基丙醛的積累，強化3-羥基丙醛轉化為1,3-丙二醇，從而提高1,3-丙二醇的產量。

本發明的技術方案如下：

一種高效生產1,3-丙二醇的基因工程菌，所述基因工程菌同時強化表達1,3-丙二醇氧化還原酶和甲酸脫氫酶。

根據本發明優選的，所述基因工程菌為重組的肺炎克雷伯氏菌。

根據本發明優選的，所述1,3-丙二醇氧化還原酶為來自肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化還原酶，其編碼基因為Dhat，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者來自大腸桿菌的1,3-丙二醇氧化還原酶同工酶，其編碼基因為YqhD，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根據本發明優選的，所述甲酸脫氫酶為來自奧奈達希瓦式菌MR-1的甲酸脫氫酶，其編碼基因為FdhD，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根據本發明優選的，所述基因工程菌構建所用的表達載體中1,3-丙二醇氧化還原酶基因位于甲酸脫氫酶基因的上游，1,3-丙二醇氧化還原酶基因的表達采用1,3-丙二醇氧化還原酶基因啟動子。

根據本發明優選的，所述1,3-丙二醇氧化還原酶的酶活是出發菌株的3.25-3.5倍，所述甲酸脫氫酶的酶活為0.414-0.45U/mg。