[發明專利]檢測大腸桿菌內氟含量的方法

有效

• 申請號: 202010934124.2
• 申請日: 2020-09-08
• 公開（公告）號: CN112034021B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 王玉花;武子辰;邢安琪;徐曉寒;田志強;房婉萍;朱旭君;馬媛春
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/333;G01N21/33
• 代理公司: 南京華恒專利代理事務所(普通合伙) 32335
• 代理人: 裴素艷

本發明屬于微生物檢測領域，涉及一種檢測大腸桿菌內氟含量的方法，包括：1）配制含有不同濃度氟的LB液體培養基；2）在LB液體培養基中加入野生型大腸桿菌菌株并振蕩培養；3）紫外檢測在野生型大腸桿菌生長的OD600值；4）收集培養的菌液后離心，倒掉上清液，重懸浮再離心后倒掉上清液后再重懸浮，水浴加熱，冷卻后離心；5）取上清液，用氟離子選擇性電極進行測定，得到氟離子濃度C；6）計算得到野生型大腸桿菌內累積的氟含量。本發明提供了一種檢測大腸桿菌內氟含量的方法，為含氟抗菌藥物的研發提供濃度參考和配比依據，解決含氟抗菌藥物研發時無法分別確定藥物中氟和致死成分的有效濃度的問題。

技術領域

本發明屬于微生物檢測領域，涉及一種檢測大腸桿菌內氟含量的方法。

背景技術

大腸桿菌是一種條件致病菌，在合適的條件下能夠寄居在人或動物的腸道內，容易引發胃腸道感染等疾病。大腸桿菌感染的發生與流行傳播是呈世界性分布并具有區域性分布的特點，尤其是患病或帶菌的動物往往會成為動物來源食品污染的根源，如來自帶菌牛的牛肉或奶制品，來自帶菌雞的雞蛋或雞肉制品。而且患病或帶菌動物也可通過排泄的糞便來污染當地的草場、水源等，從而造成交叉污染，甚至會區域性爆發大腸桿菌疫情。大腸桿菌感染后癥狀較輕的通常只會引起腹瀉，但對于免疫力本身就低下的嬰幼兒、年長者及患者，嚴重的會引發大腸桿菌性腦膜炎、敗血癥等疾病。因此抗菌治療及抗菌藥物的研發十分重要。

在進行抗大腸桿菌治療時，常用氟喹諾酮類，如諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星等這類含氟的抗菌藥物。含氟藥物具有用量少、毒性低、藥效高、代謝功能強等特點。但含氟藥物的廣泛使用和濫用，導致大腸桿菌對藥物的敏感性逐漸降低，耐藥大腸桿菌出現并快速傳播著。大腸桿菌的耐藥機制主要分為兩類，一類是基因突變或蛋白變化導致的抗生素作用位點改變或者是大腸桿菌自身產生了破壞抗生素結構的酶類，這一類機制會使得抗生素中的致死成分失效或活性減弱；另一類機制是與抗生素攝入有關的，大腸桿菌發生突變導致的某種特異膜孔蛋白丟失或發生形狀或數量的改變，致使抗生素的通透性降低，或者是大腸桿菌自身的主動外排系統將藥物選擇性或非選擇性地排出了細胞，這一類機制會使得進入細胞的藥物量減少，因此抑菌作用減弱。

含氟藥物中的氟主要發揮增加藥物脂溶性、增強對組織細胞的穿透力的作用，能夠很大程度上幫助增加藥物中致死成分的抗菌譜和殺菌效果，因此適當增加藥物中氟的比例能夠有效抑制耐藥大腸桿菌的生長。但也不能為了抑菌效果一味增大氟的比例，因為氟攝入量超標會增加氟中毒的風險，因此藥物中殘留的氟如果過多也會反過來傷害人體。在藥物研發時，常利用外源施加含氟藥物來處理大腸桿菌，通過判斷大腸桿菌的生長活性來找到抑制大腸桿菌的藥物濃度。常規的藥敏試驗只能判斷出抑菌藥物的有效濃度范圍，無法分別確定藥物中氟和致死成分的有效濃度。但若通過測定大腸桿菌中累積的氟含量就可以得到直接發揮作用的氟成分濃度，可以幫助調整合成抗菌藥物的成分配比。

發明內容

為了解決背景技術中存在的上述技術問題，本發明提供了一種檢測大腸桿菌內氟含量的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種檢測大腸桿菌內氟含量的方法，所述檢測大腸桿菌內氟含量的方法包括以下步驟：

1)配制含有不同濃度氟的LB液體培養基；

2)分別向步驟1)配置得到的含有不同濃度氟的LB液體培養基中加入野生型大腸桿菌菌株并振蕩培養；

3)紫外檢測在含有不同濃度氟的LB液體培養基中野生型大腸桿菌生長的OD600值；

4)分別收集步驟3)中培養的菌液后離心，倒掉上清液，重懸浮再離心后倒掉上清液后再重懸浮，水浴加熱，冷卻后離心；

5)取步驟4)中最后得到的上清液，用氟離子選擇性電極進行測定，得到氟離子濃度C；