[發(fā)明專利]一種利用受體基因沉默技術(shù)構(gòu)建和鑒定女性AD模型的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010932887.3
• 申請日: 2020-09-08
• 公開（公告）號: CN112189624A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 侯雪芹;榮翠平
• 申請（專利權(quán)）人: 山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027
• 代理公司: 深圳市創(chuàng)富知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44367
• 代理人: 汪學品

本發(fā)明公開了一種利用催產(chǎn)素受體基因沉默技術(shù)構(gòu)建女性AD模型的方法及鑒定方法，通過構(gòu)建并篩選得到AAV9?Oxtr?RNAi載體，利用腦立體定位將AAV9?Oxtr?RNAi病毒注射大鼠基底核區(qū)，根據(jù)腦部感染病理狀態(tài)，結(jié)合臨床女性因雌激素下降引起的老年癡呆癥狀進行檢測評估，將大鼠隨機分為sham組、con?shRNA對照組、OXTR?shRNA組，采用行為學Morris水迷宮實驗和明暗箱實驗檢測大鼠的學習記憶能力；Elisa試劑盒檢測大鼠腦組織皮質(zhì)雌激素（Estrogen，E2）水平和乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)（acetylcholine,Ach）水平變化；結(jié)合免疫熒光技術(shù)，觀察腦基底核膽堿能神經(jīng)元纖維投射區(qū)海馬的傳入神經(jīng)纖維分別與OTR、ChAT的共定位及表達情況，可更好地探索和研究女性阿爾茨海默病的發(fā)病機制及其病理變化提供依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及受體基因沉默技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用受體基因沉默技術(shù)構(gòu)建和鑒定女性AD模型的方法。

背景技術(shù)

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種慢性進行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，為常見的癡呆類型，其發(fā)病率逐年增加。目前，我國AD患者達到600萬-1000萬人，已是繼心血管疾病和腫瘤之后的老年人死亡的第三大病因。膽堿能損傷是AD發(fā)病機制的核心，表現(xiàn)為神經(jīng)元突觸功能異常、錐體神經(jīng)細胞丟失以及乙酰膽堿大量降解等，進而引起和促進一系列病理變化，最終導(dǎo)致AD復(fù)雜多樣的病理特征和臨床表現(xiàn)。因此臨床上用于治療AD的一線藥物主要是擬膽堿藥物，但其治療效果并不理想，僅對1/3患者有改善，且不能完全控制疾病的發(fā)展，其長期效用也需進一步證實。由此可見，開發(fā)不僅能夠?qū)δ憠A能神經(jīng)元有調(diào)節(jié)作用，而且對多個AD特征的病理變化也有作用的新藥將具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應(yīng)用前景。

最新流行病學調(diào)查表明：1990-2014年65歲以上老年癡呆患病率為3%-8%，隨著年齡組越高，患病率越高。60-64歲、65-69歲患病率男性高于女性，70-74歲、75-79歲、80-84歲、85歲以上患病率女性高于男性。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)早期開始給予雌激素補充治療，持續(xù)5年時間，女性患AD的風險下降30％左右，連續(xù)使用10年以上，該風險降低更顯著，尤其對于一些語言能力障礙、認知能力差的婦女有明顯的效果?？梢姡珹D高發(fā)群體為高齡老人和女性群體，除了女性平均壽命較長的原因外，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平迅速下降也與AD之間存在某種聯(lián)系。雌激素作為神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的信號分子，不僅影響神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，還具有促進神經(jīng)元存活、生長、修復(fù)、再生和神經(jīng)突觸可塑性等重要作用。膽堿能損傷是AD發(fā)生的關(guān)鍵機制，是神經(jīng)元凋亡等其他AD發(fā)病機制的重要基礎(chǔ)，最新的研究證實膽堿能和雌激素在腦內(nèi)形成網(wǎng)絡(luò)作用，通過各自信號通路發(fā)生相互作用改善AD病理狀態(tài)。因此，尋找特異性的干擾膽堿能和雌激素相關(guān)信號通路的動物模型，可能成為防治女性老年癡呆的關(guān)鍵，也將成為醫(yī)學界研究的熱點趨勢。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，雌激素與膽堿能通路并不是簡單運作的，它們之間存在著催產(chǎn)素，使得雌激素通路和膽堿能通路密切的相互聯(lián)系，形成“串話”（Crosstalk）。一方面，雌激素調(diào)控催產(chǎn)素（oxytocin，OT）在下丘腦室旁核（paraventricular nucleus，PVN）神經(jīng)細胞的合成；雌激素參與調(diào)節(jié)催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor，OTR）在靶區(qū)域的表達，進而影響社會認知行為。OT通過與OTR結(jié)合發(fā)揮作用，OTR在腦內(nèi)的表達又隨雌激素水平升高而增加。由此可見，雌激素對催產(chǎn)素通路的調(diào)控是正調(diào)控效應(yīng)。另一方面，不僅在以膽堿能神經(jīng)元為主的基底前腦Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）中有大量催產(chǎn)素受體，而且在與學習記憶密切相關(guān)的膽堿能投射靶區(qū)海馬和皮質(zhì)也有催產(chǎn)素能神經(jīng)纖維的傳入。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于通過高效AAV9-Oxtr-RNAi 構(gòu)建SD大鼠基底核區(qū)神經(jīng)元催產(chǎn)素受體腺相關(guān)病毒載體（rAVV2-EGFP-OTR shRNA）動物模型，檢測其病理形態(tài)以及腦內(nèi)關(guān)鍵遞質(zhì)變化等，更好地探索和研究女性阿爾茨海默病的發(fā)病機制及其病理變化提供基礎(chǔ)。