[發(fā)明專利]一種利用受體基因沉默技術(shù)構(gòu)建和鑒定女性AD模型的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010932887.3
• 申請(qǐng)日: 2020-09-08
• 公開（公告）號(hào): CN112189624A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯雪芹;榮翠平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）
• 主分類號(hào): A01K67/027
• 分類號(hào): A01K67/027
• 代理公司: 深圳市創(chuàng)富知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44367
• 代理人: 汪學(xué)品

1.一種利用受體基因沉默技術(shù)構(gòu)建女性AD模型的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）隨機(jī)選取50只雌性大鼠，將其分成sham組、con-shRNA對(duì)照組、OXTR-shRNA組，OXTR-shRNA組分為低劑量模型組、中劑量模型組、高劑量模型組，每組10只；

（2）動(dòng)物麻醉后，在大鼠腦立體定位儀上固定，常規(guī)頭皮消毒后，暴露前囟并標(biāo)記前囟位置，根據(jù)Paxinos和Watson的《大鼠腦立體定位圖譜》確定的基底前腦坐標(biāo)點(diǎn)（AP：-1.0mm，L：±2.7mm，V：7.8mm）調(diào)整好鉆孔位置，用三棱針在進(jìn)針處鉆孔；

（3）微量進(jìn)樣器抽取0.2μl空病毒載體rAAV2-EGFP以5nl/s的速度單側(cè)注入con-shRNA對(duì)照組的基底前腦；微量進(jìn)樣器抽取0.2μl（C=0.558 v.g/ml；C=1.116v.g/ml，C=2.232v.g/ml）病毒質(zhì)粒rAAV2-EGFP-OTR shRNA以5nl/s的速度分別單側(cè)注入低劑量模型組、中劑量模型組、高劑量模型組的基底前腦，注射完后留針5min；

（4）大鼠分別于注射病毒第二周、第三周、第四周、第五周取腦和血清，用于后期實(shí)驗(yàn)研究。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用受體基因沉默技術(shù)構(gòu)建女性AD模型的方法，其特征在于：所述大鼠為6月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠。

3.一種利用受體基因沉默技術(shù)鑒定女性AD模型的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：

S1：Morris水迷宮的裝置：所述裝置包括記錄系統(tǒng)、直徑180cm、高50cm的圓形水池以及直徑12cm，高30cm的平臺(tái)，水池平均分為四象限，注內(nèi)壁為黑色，將平臺(tái)放入其中1個(gè)象限中；

S2：適應(yīng)性訓(xùn)練：為讓大鼠適應(yīng)，在測試進(jìn)行的前1天，便要將大鼠放在平臺(tái)上1min，然后從不同象限入水訓(xùn)練2次，每次120s；找不到站臺(tái)的大鼠，則人為引導(dǎo)其至站臺(tái)，保持20s；

S3：定位航行試驗(yàn)：測試第1-5天，平臺(tái)沒于水面下1-2cm，大鼠每天測試120sX4次，大鼠120s未找到平臺(tái)，則將其置于平臺(tái)停滯20s，同時(shí)記錄大鼠逃避潛伏期、游泳的路程、游泳速度；

S4：空間探索試驗(yàn)：第6天，撤掉平臺(tái)，入水點(diǎn)則設(shè)定在原平臺(tái)的對(duì)側(cè)，記錄大鼠在120s內(nèi)停滯在原平臺(tái)象限的時(shí)間、越過原平臺(tái)位置的次數(shù)和其游泳路程；

（2）明暗箱實(shí)驗(yàn)：

所述明暗箱實(shí)驗(yàn)的裝置包括觀察裝置、視頻采集卡、避暗視頻分析軟件及主控箱，所述觀察裝置由隔音箱及避暗組件構(gòu)成，大鼠的觀察裝置為250×250mm，小鼠的觀察裝置為125×125mm，所述避暗組件由由2個(gè)小室組成，之間用拱門相通，一個(gè)小室（明箱）以強(qiáng)白光照射，但不通電，另一個(gè)小室（暗室）微弱的紅光，但是底部通電間，根據(jù)大鼠喜歡在暗箱活動(dòng)，記錄大鼠去暗箱的探究潛伏期以及次數(shù)。

（3）腦組織樣品處理：

S1：行為學(xué)測試結(jié)束后，禁食12h，每組隨機(jī)抽3-4只大鼠來制備組織切片標(biāo)本，用劑量為0.3g/kg的4%水合氯醛來麻醉大鼠，經(jīng)眼球取血，靜置2小時(shí)，4℃、1000rpm、離心20mi后再分裝血清，之后保存在-80℃冰箱；

S2：扎破右心耳，從心尖處朝向主動(dòng)脈弓方向灌注0.9%生理鹽水，在流出液體并澄清后用福爾馬林沖洗，斷頭分離腦待用；

（4）ELISA法檢測學(xué)習(xí)記憶相關(guān)遞質(zhì)Ach和E2的含量

（5）免疫熒光法檢測腦組織海馬區(qū)OTR和ChAT蛋白表達(dá)：

S1：將冰凍切片于 PBS 中室溫平衡 15min，然后置于 2mol/L，鹽酸溶液中，37℃恒溫?fù)u床孵育 30min，再于 0.1mol/L硼酸溶液中孵育 2 次，每次 5min，TBS 漂洗；

S2：用 10%封閉驢血清孵育 60min，加一抗，4℃孵育過夜，然后吸出抗體，TBS 漂洗；

S3：加熒光標(biāo)記的二抗，37℃恒溫?fù)u床上孵育 1h，TBS 漂洗，將切片貼在載玻片上，蓋上蓋玻片封好；

S4：免疫熒光的結(jié)果判讀：通過DAPI 進(jìn)行染色，染色后出來的細(xì)胞核可以在紫外光的激發(fā)下顯色為藍(lán)色，陽性結(jié)果的表達(dá)情況為相應(yīng)的熒光素標(biāo)記的結(jié)果為紅色光或者粉色光。