[發(fā)明專利]一種用于檢測溶栓后腦出血31-kDa Occludin的試紙條及其制備方法和用途

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• 申請日: 2020-09-07
• 公開（公告）號: CN112147323A
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設計）人: 劉文蘭;徐跡;廖子君;雷雪萌;李夢娜;張圓
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 濰坊諾誠智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 37309
• 代理人: 李海英

1.一種檢測31-kDa Occludin蛋白降解片段的試紙條，所述試紙條由樣品墊、反應墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次貼在PVC底卡上制成，所述硝酸纖維素膜采用羊抗兔抗體作為質控線C線，采用兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG捕獲抗體在硝酸纖維素膜上作為檢測線T線，所述反應墊噴涂Fe₃O₄納米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗體偶聯(lián)復合物，所述反應墊采用含有1-2%的Casein-PBS和0.5%-1% Triton X-100進行預處理。

2.根據權利要求1所述的檢測31-kDa Occludin蛋白降解片段的試紙條，其特征在于，所述反應墊采用含有1.5%的Casein-PBS和0.75% Triton X-100進行預處理，所述預處理為浸泡5min。

3.根據權利要求1所述的檢測31-kDa Occludin蛋白降解片段的試紙條，其特征在于，所述試紙條用濃度為2mg/mL的羊抗兔抗體在硝酸纖維素膜上劃線作為質控線C線；用濃度為3mg/mL 的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG捕獲抗體在硝酸纖維素膜上線作為檢測線T線。

4.根據權利要求1-3任意一項所述檢測31-kDa Occludin蛋白降解片段的試紙條，其特征在于，將濃度為 1.5 mg/mL Fe₃O₄納米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗體偶聯(lián)復合物噴涂至反應墊上。

5.根據權利要求1-4任意一項所述檢測31-kDa Occludin蛋白降解片段的試紙條，其特征在于，所述Fe₃O₄納米酶-抗31-kDa Occludin蛋白抗體偶聯(lián)復合物的制備方法為：

（1）配制1mL活化劑，所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC和N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合物，且所述EDC和NHS的物質的量之比為1:1；

（2）向步驟的活化劑中加入分散度好、粒徑均一的Fe₃O₄納米酶5mg，渦旋振蕩，放置在靜音混合器中充分反應30min；將100μg的兔抗31-kDa Occludin蛋白的IgG抗體與500μL醋酸鈉溶液混合后加入至步驟的活化后的納米酶溶液中，振蕩混勻，置于4℃旋轉混勻儀孵育過夜；所述醋酸鈉溶液的pH為6.0，所述醋酸鈉溶液的摩爾濃度為50mmo l/L；

（3）將孵育過夜溶液放置磁力架上，待溶液透明棄上清，加入1mL終止液，放置于4℃的旋轉混勻儀中3h，然后磁分離去除上清；所述終止液為Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的濃度為0.05mol/L，pH為7.2；

（4）加入1mL的5％BSA-PBS溶液，超聲混勻，放置在4℃的旋轉混勻儀上2h，期間振蕩2-3次，最后磁性分離棄上清后，加入500μL的質量體積分數為1％BSA-PBS溶液，制成抗體納米酶偶聯(lián)復合物，4℃保存。

6.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1-5任意一項所述的檢測31-kDaOccludin蛋白降解片段的試紙條。

7.權利要求1-5任意一項檢測31-kDa Occludin蛋白降解片段的試紙條的制備方法，其特征在于，將樣品墊、反應墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次貼在PVC底卡上，所述6cm的PVC底板上依次貼上長度為2cm的吸水墊、長度為2.5cm的硝酸纖維素膜和長度為分別為1.5cm的樣品墊和反應墊，制成空白試紙條；所述C線和T線的寬度均為1mm；采用切條機切成寬度為4.5mm的試紙條。