[發明專利]雙鼠李糖脂生產菌株、構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010924374.8
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112941001A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 陳玲;汪江林
• 申請（專利權）人: 上海恒什生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/90;C12N1/38;C12P19/44;C12R1/385
• 代理公司: 上海科律專利代理事務所(特殊普通合伙) 31290
• 代理人: 葉鳳

雙鼠李糖脂生產菌株、構建方法及其應用。以銅綠假單胞菌PAO1菌株作為出發菌株，利用同源重組的方法分別將其自身rhlAB基因簇的啟動子替換為阿拉伯糖誘導型啟動子，rhlC基因啟動子替換為菌株生長穩定期誘導的啟動子，獲得了一株能夠專一性生產雙鼠李糖脂的銅綠假單胞菌菌株PD2；該基因工程重組菌株PD2利用市售的金龍魚葵花籽油作為底物制備雙鼠李糖脂的濃度達到35.2g/L，純度達到91.27％，其中Rha?Rha?C₁₀?C₁₀的比例最大，占比為65.43％。進一步結合隨機誘變，篩選出一株雙鼠李糖脂生產水平顯著提高的突變菌株PD08。該突變菌株利用市售的金龍魚葵花籽油作為底物，在5L的生物反應器中，于37℃發酵90小時，雙鼠李糖脂的濃度達到65.0g/L，純度達到94.53％，其中Rha?Rha?C₁₀?C₁₀的比例最大，占比為73.91％。

【技術領域】

本發明所屬生物技術領域。

【背景技術】

鼠李糖脂是由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或者伯克氏菌(Burkholderia)分泌的一類表面活性分子，屬于生物表面活性劑。它具備生物可降解、低毒性、在極端環境下仍有效等的特性。另外，還具備抑制微生物、皮膚相容性以及螯合重金屬離子處理重金屬污染、促進微溶性的有機化合物的溶解和生物降解。鼠李糖脂的這些特性使得它能夠廣泛應用于生物防治、化妝品、醫藥、洗滌劑、環境清潔以及是由開采等領域。

通常表說的“鼠李糖脂”不是一種單一的結構體，而是由很多種同族結構組成的混合物，在已知的報道中已經發現多達28種不同結構的鼠李糖脂結構。其具備一般表面活性劑的基本特征，其親水基團一般由1～2分子的鼠李糖環構成，疏水基團則由1～2分子具有不同碳鏈長度的飽和或不飽和脂肪酸構成。銅綠假單胞菌分泌的鼠李糖脂的脂鏈一般包括兩個鏈長相同的羥基脂肪酸鏈，結構可以表示為RhaC₁₀C₁₀和Rha₂C₁₀C₁₀。而不同結構的鼠李糖脂同系物的分布成為了限制鼠李糖脂商品化的一個主要問題。這是由于不同結構的鼠李糖脂具備不同的溶解性以及表面活性，從而會影響鼠李糖脂產品的物理化學性質以及產品在高端領域的應用。

為了提高鼠李糖脂在高端領域的應用價值，往往需要對發酵液中的鼠李糖脂產品進行多級的純化，已有的數據表明，后期純化鼠李糖脂的成本占到總成本的75％左右。因此，一般通過化學合成工藝制備純度較高的同種鼠李糖脂，例如GlycoSurf公司使用化學方法生產的鼠李糖脂，原料為鼠李糖，他們可以利用鼠李糖生產多種鼠李糖脂，從而能夠更好地滿足客戶需求，還減少了發酵和分離過程的成本，得到更高的產量。但化學合成工藝復雜，成本居高不下。

典型模式菌株銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1 as a modelfor rhamnolipid production in bioreactor systems.Applied Microbiology andBiotechnology,2010,87(1):167-174.)

【發明內容】

為了有效地減少下游雙鼠李糖脂分離純化的過程從而有效地節約成本，本申請改用基因工程的方法構建一株能夠專一性生產雙鼠李糖脂，能替代傳統方法生產高純度的雙鼠李糖脂的能力的菌株。本申請以銅綠假單胞菌PAO1菌株作為出發菌株，該銅綠假單胞菌PAO1通過市場采購即可獲得(舉例而非限定，可購買自生物風，產品目錄號:15692。

針對現有技術的不足，本發明需要解決的問題是獲得能夠高效生產雙鼠李糖脂的菌株，并利用該突變菌株進行發酵，生產高濃度、高純度的雙鼠李糖脂。

本申請給出技術方案：

技術方案一

菌種