[發明專利]一種快速檢測慢病毒載體滴度的方法

在審

• 申請號: 202010922956.2
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN114134251A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 王澤發;李黎;張漢寧;曹怡浪;韓婷;陸吉順;洪誼;張麗
• 申請（專利權）人: 西比曼生物科技（香港）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 黃革生

本發明提供了一種快速檢測慢病毒載體滴度的方法，具體地，本發明提供了一種測定慢病毒載體滴度的方法，包括：(a)提供一待測樣品，所述待測樣品含有慢病毒載體和游離的質粒DNA；(b)對所述待測樣品分別進行RT?PCR和PCR反應，從而獲得待測樣品中含有WPRE元件的拷貝數，所述含有WPRE元件的拷貝數包括含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數以及含有WPRE元件的游離質粒DNA的拷貝數；(c)基于所述待測樣品中含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數，從而測定慢病毒載體滴度。本發明的方法可在2小時之內獲得特異性定量結果，可用于快速定量評估慢病毒載體生產過程中各步驟中間產品的滴度，并且可以對終產品滴度實施控制。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體地，本發明涉及一種快速檢測慢病毒載體滴 度的方法。

背景技術

基因治療(gene therapy)是指將外源治療性基因導入靶細胞，以糾正或 補償因基因缺陷或異常引起的疾病，或通過外源基因表達的產物作用于疾病 靶點，以達到治療目的。

外源基因可通過病毒載體或非病毒載體進行轉導或遞送，常用的非病毒 載體有脂質體、樹枝狀大分子、非天然陽離子聚合物、天然多糖等。非病毒 基因遞送載體比較安全、穩定，但其轉染效率通常較低。病毒載體是將外源 基因包裝到天然病毒的外殼中，利用病毒對宿主細胞的感染性將外源基因導 入細胞中。常見的病毒載體包括逆轉錄病毒(recombinant retrovirus，rRV)， 重組慢病毒(recombinant lentivirus，rLV)、腺病毒(recombinant adenovirus， rAd)、腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)等。病毒載 體的轉導效率比非病毒載體的轉導效率要高很多，特別適合用于侵染難感染 的靶細胞，如淋巴細胞。

重組慢病載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基 因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具 有感染能力。重組慢病載體因其體內、外生物滴度高和免疫原性低等優勢， 成為CART細胞和基因治療的首選轉基因載體。

目前重組慢病毒載體檢測多使用p24Elisa方法和生物滴度定量法，前者 需要1天時間出結果，后者至少需要7天時間出結果，且有較高的非特異性。

因此，本領域迫切需要開發一種快速檢測慢病毒載體滴度的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速檢測慢病毒載體滴度的方法。

本發明的第一方面，提供了一種測定慢病毒載體滴度的方法，包括：

(a)提供一待測樣品，所述待測樣品含有慢病毒載體和游離的質粒DNA；

(b)對所述待測樣品分別進行RT-PCR和PCR反應，從而獲得待測樣品中含 有WPRE元件的拷貝數，所述含有WPRE元件的拷貝數包括含有WPRE元件的 慢病毒載體中RNA的拷貝數以及含有WPRE元件的游離質粒DNA的拷貝數；

(c)基于所述待測樣品中含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數， 從而測定慢病毒載體滴度。

在另一優選例中，所述待測樣品中含有WPRE元件的慢病毒載體中的RNA 的拷貝數用如下公式計算：含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數和含 有WPRE元件的游離質粒DNA的總拷貝數－含有WPRE元件的游離質粒DNA的 拷貝數。

在另一優選例中，“基于所述待測樣品中含有WPRE元件的慢病毒載體中 RNA的拷貝數”包括用公式Q1進行計算，從而獲得慢病毒載體滴度：

Q1＝(待側樣品中重組慢病毒載體RNA的拷貝數*陽性品生物滴度)/陽性品 中重組慢病毒載體RNA的拷貝數；