[發明專利]一種快速檢測慢病毒載體滴度的方法

在審

• 申請號: 202010922956.2
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN114134251A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 王澤發;李黎;張漢寧;曹怡浪;韓婷;陸吉順;洪誼;張麗
• 申請（專利權）人: 西比曼生物科技（香港）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 黃革生

1.一種測定慢病毒載體滴度的方法，其特征在于，包括：

(a)提供一待測樣品，所述待測樣品含有慢病毒載體和游離的質粒DNA；

(b)對所述待測樣品分別進行RT-PCR和PCR反應，從而獲得待測樣品中含有WPRE元件的拷貝數，所述含有WPRE元件的拷貝數包括含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數以及含有WPRE元件的游離質粒DNA的拷貝數；

(c)基于所述待測樣品中含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數，從而測定慢病毒載體滴度。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣品中含有WPRE元件的慢病毒載體中的RNA的拷貝數用如下公式計算：含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數和含有WPRE元件的游離質粒DNA的總拷貝數－含有WPRE元件的游離質粒DNA的拷貝數。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，“基于所述待測樣品中含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數”包括用公式Q1進行計算，從而獲得慢病毒載體滴度：

Q1＝(待側樣品中重組慢病毒載體RNA的拷貝數*陽性品生物滴度)/陽性品中重組慢病毒載體RNA的拷貝數；

其中，陽性品指已知生物滴度的慢病毒載體懸液；陽性品生物滴度和陽性品中RNA的拷貝數的計算公式與待測樣品的計算公式相同；待側樣品中重組慢病毒載體RNA的拷貝數用如下公式計算：含有WPRE元件的慢病毒載體中RNA的拷貝數和含有WPRE元件的游離質粒DNA的總拷貝數－含有WPRE元件的游離質粒DNA的拷貝數。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，利用特異性擴增含有WPRE元件的重組慢病毒載體的上游引物和下游引物和利用特異性擴增含有WPRE元件的游離質粒DNA的上游引物和下游引物對待測樣品進行RT-PCR反應，對重組慢病毒載體內的RNA和游離質粒DNA進行擴增，從而獲得特異性擴增WPRE元件的重組慢病毒載體中的RNA和游離質粒DNA的Ct值。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，利用特異性擴增含有WPRE元件的游離質粒DNA的上游引物和下游引物對待測樣品進行PCR反應，對游離質粒DNA進行擴增，從而獲得特異性擴增WPRE元件的游離質粒DNA的Ct值。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，基于特異性擴增WPRE元件的游離質粒DNA的Ct值，從而獲得特異性擴增WPRE元件的游離質粒DNA的含量(拷貝數)。

7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，基于特異性擴增WPRE元件的重組慢病毒載體中的RNA和游離質粒DNA的Ct值，用公式Q2進行計算，從而獲得重組慢病毒載體中的RNA和游離質粒DNA的總拷貝數：

Q2＝RNA和/或DNA拷本數＝(每個反應孔中樣品的核酸拷貝數×1000×稀釋倍數)/每個反應孔中加入樣品的量；

其中，每個反應孔中樣品的核酸拷貝數＝10^^(aX+b)，

其中，X：待測樣品檢測得到的CT值平均值；

a:標準曲線擬合得到的系數

b:標準曲線擬合得到的截距。

8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，基于重組慢病毒載體中的RNA和游離質粒DNA的總拷貝數，以及游離質粒DNA的拷貝數，用公式Q3進行計算，從而獲得待測樣品中的重組慢病毒載體中RNA的拷貝數：

Q3＝重組慢病毒載體中的RNA和游離質粒DNA的總拷貝數-游離質粒DNA的拷貝數。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中還包含陽性對照。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣品中慢病毒載體的濃度為5x10⁵-5x10⁹Tu/ml，較佳地，1x10⁶-8x10⁸Tu/ml，更佳地，5x10⁶-5x10⁸Tu/ml。