[發明專利]基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法

有效

• 申請號: 202010919717.1
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112011513B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 易強英;康珂;吳堯;張宇佳;朱南行;李國浩
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 何凡

本發明公開了一種基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，包括以下步驟：S1.制備超順磁性四氧化三鐵納米粒子；S2.制備仿生磁性囊泡；S3.仿生磁性囊泡的功能化修飾；S4.腫瘤細胞表面生長疊氮基因；S5.循環腫瘤細胞的捕獲。本發明將超順磁性四氧化三鐵納米粒子與巨噬細胞孵育后，可通過小鼠巨噬細胞經過類似外泌體釋放的途徑，產生仿生磁性囊泡，隨后進行功能化修飾；腫瘤細胞則預先通過自身細胞內新陳代謝在細胞膜表面生成功能化基團，與功能化后的磁性囊泡孵育，兩個功能基團通過生物正交化學結合，實現對循環腫瘤細胞的捕獲，該方式具有運用到液體活檢方面的潛力。

技術領域

本發明屬于生物醫學材料技術領域，具體涉及一種基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法。

背景技術

循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，主要指自發或因診療操作脫離實體瘤原發灶或轉移灶而進入外周血循環的腫瘤細胞。CTCs在逃避機體的免疫殺傷而存活下來后，可隨血液播散后轉運到遠端組織滲出，在各類生長因子的作用下，適應新的微環境，在其他部位形成新的轉移灶。循環腫瘤細胞在外周血中十分稀少，同時在形態和類別上存在一定的異質性，如腫瘤細胞在進入外周血循環的過程中會發生上皮-間質轉變。由于CTCs所存在的血液環境中，含有大量的白細胞和血漿蛋白等物質，這些物質的存在經常會導致捕獲平臺出現諸如CTCs純度低、靈敏度和特異性差等缺陷。

免疫磁珠分離是富集CTCs的一種重要方法，表面修飾的磁珠標記CTCs后，通過外加磁場作用，使CTCs被迅速分離。由于CTCs的異質性且存在于血液中，設計免疫磁珠平臺分離CTCs時，需要考慮到免疫磁珠的抗非特異性吸附能力以及對不同類型/亞型CTCs的富集。當前，人們廣泛運用單克隆抗體或適配子識別腫瘤細胞表面抗原或相關受體來捕獲CTCs。一方面，抗體等物質價格昂貴，易脆弱，儲存和工作條件較為苛刻；另一方面，單一的抗體或適配子不能實現對所有CTCs的識別標記。例如抗上皮細胞粘附分子(anti-EpCAM)可識別高表達上皮粘附分子的腫瘤細胞，但對于EpCAM表達下調或來源于非上皮性腫瘤的CTCs，修飾抗上皮細胞粘附分子(anti-EpCAM)的磁珠則不能實現對這一類CTCs有效的捕獲和富集。

發明內容

本發明的目的在于：針對上述現有技術中存在的不足，提供一種基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法。

本發明采用的技術方案如下：

一種基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，包括以下步驟：

S1.制備超順磁性四氧化三鐵納米粒子；

S2.將S1所得超順磁性四氧化三鐵納米粒子與巨噬細胞共孵育，制備仿生磁性囊泡；

S3.對S2制得的仿生磁性囊泡表面功能化修飾；

S4.將癌細胞接種在培養基中孵育70-80h，離心收集細胞，并清洗2-3次；

S5.體外樣本循環腫瘤細胞捕獲：將S4所得細胞制為細胞懸液再加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡，或將S4所得細胞的細胞核染色并加入巨噬細胞懸液中后再向其中加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡；然后在震蕩條件下孵育30-50min，隨后進行磁分離，用DPBS清洗2-3次，收集上清液；

動物血液樣本循環腫瘤細胞捕獲：將S4所得細胞打入動物體內，建立動物模型，收集動物血液，再向血液中立即加S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡，在37℃孵育1-2h，采用磁分離收集細胞，并用PBS清洗。

進一步地，體外樣本循環腫瘤細胞捕獲包括：

細胞系捕獲：將S4所得細胞計數并制成細胞懸液，加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡，震蕩條件下孵育30-50min，隨后進行磁分離，用DPBS清洗2-3次，收集上清液，對上清液中的細胞進行計數，通過以下公式計算捕獲效率：