[發明專利]基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法

有效

• 申請號: 202010919717.1
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112011513B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 易強英;康珂;吳堯;張宇佳;朱南行;李國浩
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 何凡

1.一種基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.制備超順磁性四氧化三鐵納米粒子；

S2.將巨噬細胞接種在含有10wt％胎牛血清和1wt％鏈霉素-青霉素的DMEM培養基中，于37℃、5％CO₂的條件下培養40-50h；移除原培養液，用磷酸鹽緩沖液清洗2-3次，加入含有S1制得的超順磁性四氧化三鐵納米粒子和檸檬酸鈉的無血清DMEM培養基孵育2-3h，再用無血清DMEM培養基清洗2-3次，再加入無血清DMEM培養基繼續培養45-55h，取上清液，用無血清DMEM培養基清洗2-3次，離心并棄去沉淀，對上清液進行磁分離，收集磁分離產物，并用磷酸鹽緩沖液清洗2-3次，制備仿生磁性囊泡；

S3.對S2制得的仿生磁性囊泡表面功能化修飾，具體方式為：將S2所得仿生磁性囊泡分散在含有DSPE-PEG-DBCO的磷酸鹽緩沖液中，室溫下震蕩2h，再通過磁分離回收，并用PBS清洗三次，即得；

S4.將癌細胞接種在含有Ac4ManNAz的培養基中孵育70-80h，離心收集細胞，并清洗2-3次；

S5.體外樣本循環腫瘤細胞捕獲：將S4所得細胞制為細胞懸液再加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡，或將S4所得細胞的細胞核染色并加入巨噬細胞懸液中后再向其中加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡；然后在震蕩條件下孵育30-50min，隨后進行磁分離，用DPBS清洗2-3次，收集上清液；

動物血液樣本循環腫瘤細胞捕獲：將S4所得細胞注射入動物體內，建立動物腫瘤模型，然后向動物腫瘤部位注射Ac4ManNAz后再收集動物血液，再向血液中立即加S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡，在37℃孵育1-2h，采用磁分離收集細胞，并用PBS清洗。

2.根據權利要求1所述的基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述S1具體制備方式為：將六水三氯化鐵溶解在乙二醇中，邊攪拌邊加入檸檬酸鈉，最后加入醋酸銨，室溫下磁攪拌1-3h后置于180-250℃條件下保溫15-20h，冷卻，再采用磁分離法收集沉積物，并用乙醇和去離子水清洗3-5次，最后再次磁分離，即得。

3.根據權利要求2所述的基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述六水三氯化鐵、檸檬酸鈉和醋酸銨的質量比為2-3:1:8-9。

4.根據權利要求1所述的基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述巨噬細胞為小鼠巨噬細胞J774A.1、P338D1、S774A.1或RAW264.7；超順磁性四氧化三鐵納米粒子的濃度為0.2-0.3mg/mL,檸檬酸鈉的濃度為1.2-1.35mg/mL。

5.根據權利要求1所述的基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述S4中癌細胞為人肺癌細胞A549和人肝癌細胞HepG2。

6.根據權利要求1所述的基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述S5中細胞懸液濃度為1×10⁵-1×10⁷/mL。

7.根據權利要求1所述的基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述S5中采用Hoechst33342染色細胞核。

8.根據權利要求1所述的基于生物正交化學法捕獲高純度循環腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述S5中建立動物腫瘤模型后向動物腫瘤部位注射50mM的Ac₄ManNAz50μL，每天一次，共注射四次，然后再收集動物血液。