[發(fā)明專利]一種可連續(xù)收獲且無需酶消化的2D、3D細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2020-09-03
• 公開（公告）號(hào): CN112210536A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李順;劉貽堯;李亭亭;秦翔;楊紅;吳春惠
• 申請（專利權(quán)）人: 電子科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12N5/071;C12N5/00;C12Q1/02
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11870
• 代理人: 李林合

本發(fā)明公開了一種可連續(xù)收獲且無需酶消化的2D、3D細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。其構(gòu)建方法為：(1)制備帶有微陣列圖案的印章；(2)帶微陣列圖案培養(yǎng)基底的制備；(3)2D、3D細(xì)胞共培養(yǎng)于微圖案培養(yǎng)基底；(4)獲得3D細(xì)胞微球與2D細(xì)胞共培養(yǎng)體系。本發(fā)明提供的可連續(xù)收獲、無需酶消化的細(xì)胞2D、3D共培養(yǎng)體系，能夠使細(xì)胞在同一環(huán)境下實(shí)現(xiàn)2D、3D共存的培養(yǎng)，如需獲取3D細(xì)胞微球，可通過簡單的吸管吹打收獲，無需酶消化；且基底細(xì)胞仍可繼續(xù)生成3D細(xì)胞微球，如同種植植物可實(shí)現(xiàn)連續(xù)的收獲，同時(shí)，3D細(xì)胞微球的形成無需添加膠原、海藻酸鈉等材料，減少研究中外源細(xì)胞外基質(zhì)的影響。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞共培養(yǎng)體系技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可連續(xù)收獲且無需酶消化的2D、3D細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)是生物、醫(yī)學(xué)研究中的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在基礎(chǔ)研究、藥物評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)中具有不可替代的作用。然而，目前細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)仍然有一些問題亟待解決。

1、2D的培養(yǎng)條件無法反映細(xì)胞真實(shí)的3D培養(yǎng)環(huán)境。

2、目前常用的3D細(xì)胞培養(yǎng)體系需要添加膠原、海藻酸鈉等凝膠或固體成分作為支架，如果選擇不善，材料組成與真實(shí)細(xì)胞環(huán)境差異很大。

3、也有某些特定細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)，由于具有很強(qiáng)自我更新能力能夠在懸浮培養(yǎng)時(shí)自行形成微球，但是微球自由在培養(yǎng)液中懸浮，無法固定，影響定點(diǎn)、定時(shí)觀察。

4、目前3D細(xì)胞培養(yǎng)相對于2D培養(yǎng)，技術(shù)復(fù)雜，需要每次按需制備，無法實(shí)現(xiàn)可持續(xù)獲取。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供一種可連續(xù)收獲且無需酶消化的 2D、3D細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了3D細(xì)胞培養(yǎng)與2D細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行、無需添加凝膠類細(xì)胞支架、可連續(xù)獲得3D培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)、實(shí)現(xiàn)固定化培養(yǎng)的細(xì)胞2D、3D共培養(yǎng)體系。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種構(gòu)建可連續(xù)收獲且無需酶消化的2D、3D細(xì)胞共培養(yǎng)體系的方法，包括以下步驟：

(1)制備帶有微陣列圖案的印章；

(2)在印章表面滴加胞外基質(zhì)蛋白工作液，孵育30～60min后，于50～60℃烘干，然后加壓使印章與培養(yǎng)基底底部接觸5～10min，使培養(yǎng)基底帶有微陣列圖案，再封閉微陣列圖案中不含細(xì)胞外基質(zhì)的位點(diǎn)；

(3)向步驟(2)所得培養(yǎng)基底中以1.0～5.0×10⁴個(gè)/mL的密度接種細(xì)胞，然后35～37℃，5～10％CO₂培養(yǎng)至90％以上的微陣列團(tuán)中均有細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基；其中，新鮮培養(yǎng)基的選擇根據(jù)培育的細(xì)胞種類而定，每種細(xì)胞對應(yīng)的培養(yǎng)基參考ATCC推薦使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

(4)于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3～5天后，即可獲得合適大小的3D細(xì)胞微球與2D 細(xì)胞共培養(yǎng)體系。

進(jìn)一步地，帶有微陣列圖案的印章的制備過程為：

利用UV光刻制備規(guī)格為100×100μm的圖案陣列，然后使用道康寧184倒模，即可制備得到PDMS印章，清洗備用。

進(jìn)一步地，微陣列圖案的單一圖形形狀無特殊要求，以圓形、矩形等規(guī)則圖形容易分辨為優(yōu)，面積大小為40-10000μm²。

進(jìn)一步地，細(xì)胞外基質(zhì)為纖連蛋白(Fibronectin)、膠原(Collagen)、核纖層蛋白(Lamin)、等細(xì)胞外基質(zhì)或市售Matrigel等細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物，工作濃度為10～1000μg/mL。

進(jìn)一步地，胞外基質(zhì)蛋白工作液為濃度為20μg/mL的纖連蛋白工作液。