[發(fā)明專利]一種蛋白核小球藻葉綠體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010917692.1
• 申請日: 2020-09-03
• 公開（公告）號: CN112226452B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李雁群;符虹宇;梁皓輝;楊青峰;朱宏波;簡紀(jì)常;胡雪瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 劉瑤云;陳偉斌

本發(fā)明公開了一種蛋白核小球藻葉綠體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)及其應(yīng)用，所述蛋白核小球藻葉綠體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中不小于1000bp的連續(xù)片段作為上游同源臂和下游同源臂，及插入上游同源臂和下游同源臂之間的啟動子、終止子和外源基因。本發(fā)明利用來源于蛋白核小球藻非光依賴性葉綠素酸酯氧化還原酶DPOR的基因(chlL)的序列片段作為上下游同源重組片段，成功構(gòu)建了蛋白核小球藻的葉綠體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化載體可以將外源基因?qū)氲鞍缀诵∏蛟迦~綠體，并使之在蛋白核小球藻葉綠體中高效穩(wěn)定的表達(dá)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種蛋白核小球藻葉綠體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)屬于綠藻門(Chlorophyta)綠藻綱(Chlorophyceae)綠球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻屬(Chlorella)，蛋白核小球藻在學(xué)術(shù)分類上也稱為Auxenochlorella pyrenoidosa。蛋白核小球藻細(xì)胞呈球形或橢圓形，細(xì)胞壁較堅固，含有1個呈杯狀葉綠體。自養(yǎng)生長下的葉綠體內(nèi)常有1個色素體，1個淀粉核，細(xì)胞直徑約5μm。蛋白核小球藻既可以自養(yǎng)生長，也可以異養(yǎng)生長。

蛋白核小球藻的蛋白質(zhì)含量可高達(dá)55％～65％，可作為優(yōu)良植物蛋白源。在特定的培養(yǎng)條件下，蛋白核小球藻總脂含量可以達(dá)到細(xì)胞干重的38％以上，不飽和脂肪酸含量可高達(dá)總脂肪酸的75％，其中亞油酸含量約47％，亞麻酸含量約10％，油脂產(chǎn)率可達(dá)126.3mg/(L·d)以上。蛋白核小球藻還富含蘆丁、類胡蘿卜素等營養(yǎng)素，是優(yōu)良的食品資源。蛋白核小球藻已經(jīng)被我國原衛(wèi)生部批準(zhǔn)為食品新資源。由于蛋白核小球藻具有良好的食品安全性，是少有幾種可作為食品材料的微藻之一，可以用其加工食品或飼料。利用蛋白核小球藻作為轉(zhuǎn)基因宿主開發(fā)基因工程食品和飼料或者其他生物活性物質(zhì)，宿主安全性具有保證。因此，利用蛋白核小球藻開發(fā)轉(zhuǎn)基因食品、藥品、疫苗等相比于其他微藻具有優(yōu)勢。

蛋白核小球藻與其他光合作用真核細(xì)胞一樣具有細(xì)胞核、葉綠體和線粒體三套DNA分子，構(gòu)成既獨立又相互聯(lián)系的遺傳體系。在細(xì)胞內(nèi)的三套遺傳體系中，核基因組遺傳體系具有一些明顯的困難：(1)細(xì)胞核基因組龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜；(2)在基因轉(zhuǎn)化過程中外源基因被隨機插入到基因組的不確定位置中，常常無法表達(dá)而成為沉默基因；(3)外源基因表達(dá)效率低，且表達(dá)不穩(wěn)定；(4)外源基因的插入有時會改變其他重要性狀而降低宿主的生命力或者降低經(jīng)濟(jì)價值；(5)外源基因容易擴(kuò)散，可能有對環(huán)境的基因污染的風(fēng)險等。

葉綠體是微藻光合作用的場所，其遺傳物質(zhì)為雙鏈環(huán)狀DNA。通常一個葉綠體中有多個基因組拷貝。葉綠體基因組大小在120～160kb，GC含量在25％～38％。葉綠體基因組具有原核生物基因的特點，與功能相關(guān)的基因多為多順反子轉(zhuǎn)錄單位其排列順序具有高度保守性。1988年在萊茵衣藻上首次開展了葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化，此后，葉綠體轉(zhuǎn)基因研究在其他微藻和煙草等植物中開展。與核轉(zhuǎn)化相比，葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)具有如下特點：(1)外源基因通過同源片段精確定點插入到葉綠體基因組中，可以較好解決基因失活、基因沉默、位置效應(yīng)等問題；(2)由于葉綠體中常常有多個基因組拷貝，當(dāng)同質(zhì)化后，外源基因的拷貝數(shù)高，表達(dá)效率高、基因丟失的風(fēng)險小；(3)葉綠體基因組屬于原核表達(dá)系統(tǒng)，可以以多順反子的形式將多個基因轉(zhuǎn)入葉綠體，有利于標(biāo)記基因和目的基因等進(jìn)行共同轉(zhuǎn)化；(4)對于高等植物來說，葉綠體為母系遺傳，能較好避免轉(zhuǎn)基因植物對周圍環(huán)境造成生物安全危害。

影響葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)效果的兩個關(guān)鍵因素有：(1)合適的葉綠體轉(zhuǎn)化載體；(2)有效的載體導(dǎo)入方法。葉綠體轉(zhuǎn)化載體中表達(dá)盒的設(shè)計是重要因素，其中要素包括同源片段、標(biāo)記基因和適合葉綠體的啟動子、終止子。