[發明專利]一種共表達L-蘇氨酸醛縮酶與PLP合酶的工程菌及應用

有效

• 申請號: 202010917662.0
• 申請日: 2020-09-03
• 公開（公告）號: CN112175892B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 吳堅平;鄭文隆;陳開通;徐剛;楊立榮
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N11/089;C12N11/091;C12N11/14;C12N9/88;C12N9/06;C12P13/04;C12R1/19
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• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種共表達L?蘇氨酸醛縮酶與PLP合酶的工程菌及應用。一種共表達L?蘇氨酸醛縮酶與PLP合酶的工程菌，在表達菌株中轉入L?蘇氨酸醛縮酶基因和PLP合酶基因而得。本發明工程菌中外源導入L?蘇氨酸醛縮酶基因與PLP合酶基因，兩個酶共表達，PLP合酶過表達能夠提高菌株內源性輔酶PLP的合成量，將共表達后的工程菌破碎制備粗酶液，然后將L?蘇氨酸醛縮酶和輔酶PLP共固定化制備的共固定化酶能夠顯著降低L?syn?對甲砜基苯絲氨酸生產過程中外源PLP的使用量，提高了L?蘇氨酸醛縮酶和PLP的使用效率，降低生產成本。本方法反應條件溫和、綠色環保、生產工藝簡單、重復利用效率高、成本低廉，在L?syn?對甲砜基苯絲氨酸生產中具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，特別是涉及一種共表達L-蘇氨酸醛縮酶與PLP合酶的工程菌及應用。

背景技術

L-syn-對甲砜基苯絲氨酸是一種重要的醫藥中間體，應用于多種抗生素的合成，如甲砜霉素、氟苯尼考等。

化學法合成L-syn-對甲砜基苯絲氨酸，大量使用硫酸銅，在高溫強堿條件下利用金屬離子的絡合作用生成兩種syn式的產物：L-syn-對甲砜基苯絲氨酸銅鹽和D-syn-對甲砜基苯絲氨酸銅鹽，再使用手性試劑進行拆分從而制得光學純的L-syn-對甲砜基苯絲氨酸。化學法主要存在理論收率、工藝條件復雜苛刻、環境污染大等缺點。生物法合成一般使用L-蘇氨酸醛縮酶催化甘氨酸和對甲砜基苯甲醛生成L-syn-對甲砜基苯絲氨酸。

L-蘇氨酸醛縮酶是一種PLP依賴型的酶，利用該酶能夠一步合成高光學純度的L-syn-對甲砜基本絲氨酸(圖1)。相對于步驟繁多的化學合成法，該方法具有生產工藝簡單，反應條件溫和，產品光學純度高，原子利用率高和生產過程污染較小等優點。使用L-蘇氨酸醛縮酶制備L-syn-對甲砜基本絲氨酸過程中需要添加50-100μM的PLP做為輔酶。PLP是一種多功能輔酶，參與包括消旋、轉氨、脫羧、醛縮等多種反應。然而輔酶PLP價格昂貴，增加了L-syn-對甲砜基本絲氨酸的生產成本。同時，添加的PLP在產品提純過程中不易被分離，降低產品純度。在L-syn-對甲砜基苯絲氨酸生物合成工藝中如何能夠減少甚至不加入PLP的情況下能夠保證L-蘇氨酸醛縮酶的正常催化、提高生產效率、降低生成成本是一個重要的研究方向。通過代謝調節促進大腸桿菌包內PLP濃度的相關研究已經成為當下熱點，但是目前在L-蘇氨酸醛縮酶的應用中沒有相關報道。因此構建能夠高效共表達PLP和L-蘇氨酸醛縮酶的工程菌意義重大。

目前已知的PLP代謝途徑3種：5-磷酸脫氧核酮糖依賴途徑，非5-磷酸脫氧核酮糖依賴途徑和補救途徑。PLP的5-磷酸脫氧核酮糖依賴合成途徑比較復雜，需要PdxF,PdxB,GapA/B,Dxs,PdxA,PdxJ,and PdxH等7中酶參與反應。PLP的補救途徑比較簡單，吡哆醛，吡哆醇，吡哆胺等前體經過一到兩反應可以得到。但是這些前體價格昂貴。非5-磷酸脫氧核酮糖依賴途徑獲得廣泛關注，該途徑只需要一種PLP合酶就能夠將核糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸和谷氨酰胺合成PLP。因此，如果將該PLP合成途徑引入大腸桿菌有望提高細胞體內的PLP濃度，以滿足共表達蘇氨酸醛縮酶對PLP的需求。實現在不添加外源PLP的情況下完成反應。

盡管L-蘇氨酸醛縮酶有較高的選擇性，應用前景廣闊，但是游離的酶穩定性差，不能重復利用，而且難與產物分離，限制了其在工業化中的應用。固定化酶技術在生物催化過程中應用比較廣泛。固定化酶能夠提高酶的穩定性，提高催化效率，提高酶的利用率，降低生產成本。然而在利用L-蘇氨酸醛縮酶生產L-syn-對甲砜基本絲氨酸的研究中，較少有固定化酶工藝的報道。同樣，通過對PLP固定化的方式提高PLP的利用效率有助于降低PLP的用量，但是目前在L-蘇氨酸醛縮酶的應用中沒有相關報道。特別是共固定化L-蘇氨酸醛縮酶和PLP的研究幾乎處于空白。研究共固定化L-蘇氨酸醛縮酶和PLP的工作意義重大，夠有效推動L-蘇氨酸醛縮酶在合成L-syn-對甲砜基苯絲氨酸方面的工業應用。

發明內容