[發(fā)明專利]一種共表達L-蘇氨酸醛縮酶與PLP合酶的工程菌及應用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010917662.0 | 申請日： | 2020-09-03 |
| 公開（公告）號： | CN112175892B | 公開（公告）日： | 2022-08-30 |
| 發(fā)明（設計）人： | 吳堅平;鄭文隆;陳開通;徐剛;楊立榮 | 申請（專利權）人： | 浙江大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N11/089;C12N11/091;C12N11/14;C12N9/88;C12N9/06;C12P13/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 杭州天勤知識產(chǎn)權代理有限公司 33224 | 代理人： | 沈金龍 |
| 地址： | 310013 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 表達 蘇氨酸 醛縮酶 plp 工程 應用 | ||
1.一種L-
（1）培養(yǎng)共表達L-蘇氨酸醛縮酶與PLP合酶的工程菌，收集菌體、破碎制備粗酶液；
（2）使用交聯(lián)劑預處理的固定化材料對預混液進行固定化，制得L-蘇氨酸醛縮酶與輔酶PLP的共固定化酶；
（3）使用所述共固定化酶作為催化劑，以對甲砜基苯甲醛和甘氨酸為底物進行催化反應，制備L-
所述共表達L-蘇氨酸醛縮酶與PLP合酶的工程菌為在表達菌株中轉入L-蘇氨酸醛縮酶基因和PLP合酶基因而得；L-蘇氨酸醛縮酶基因的序列如SEQ ID No.1所示；PLP合酶基因的序列如SEQ ID No.4所示；所述表達菌株為大腸桿菌，將L-蘇氨酸醛縮酶基因和PLP合酶基因構建在同一質粒上或者兩個不同質粒上，在大腸桿菌中進行共表達；當L-蘇氨酸醛縮酶基因和PLP合酶基因構建在同一質粒上時，使用的質粒載體為pRSF-Duet-1；當構建在兩個不同質粒上時，L-蘇氨酸醛縮酶基因構建在質粒pRSF-Duet-1上，而PLP合酶基因構建在pET-23a上；
步驟（3）中催化反應的反應體系如下：1 L 100 mM pH 8 的NaOH-Gly緩沖液中溶解0.1M對甲砜基苯甲醛、1 M甘氨酸，25 g共固定化酶，30℃，磁力攪拌，反應1-3 h；
步驟（2）中固定化時使用的固定化載體為氨基樹脂，交聯(lián)劑為乙醇胺；
固定化載體使用前進行預處理，預處理方法如下：
（a）將氨基樹脂用蒸餾水浸泡3個小時并不斷攪拌，重復3次，然后減壓過濾取濾餅；
（b）氨基樹脂用0.4%的戊二醛浸泡3小時并不斷攪拌，然后減壓過濾取濾餅，并用蒸餾水清洗3次；
（c）將清洗后的氨基樹脂使用0.5%乙醇胺碳酸氫鈣溶液浸泡3個小時進行包裹交聯(lián)，溫度為20℃-40℃，攪拌轉速為100rpm-200rpm，然后減壓過濾取濾餅，并用蒸餾水清洗3次。
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