[發明專利]小黃魚生長激素生物反應器家蠶品系的構建方法

有效

• 申請號: 202010915249.0
• 申請日: 2020-09-03
• 公開（公告）號: CN112159819B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 翁宏飚;牛寶龍;沈衛鋒
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/866;C12N15/66;A01K67/04
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

1.小黃魚生長激素生物反應器家蠶品系的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）設計并合成小黃魚生長激素與轉鐵蛋白融合基因，插入啟動子、終止子和His標簽，得到含有優化融合基因序列的pUC57-PcGH-TF質粒，該pUC57-PcGH-TF質粒的插入片段序列如SEQ ID No.1所示；

（2）將piggBAC載體pXL-Red與步驟（1）得到的pUC57-PcGH-TF質粒的插入片段體外重組，獲得piggBAC轉基因質粒pXL-Red-PcGH-TF，該轉基因質粒pXL-Red-PcGH-TF的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

（3）將步驟（2）得到的piggBAC轉基因質粒pXL-Red-PcGH-TF導入家蠶受精卵；

（4）飼養G0代家蠶，獲得G1代蠶種；

（5）在G1代幼蟲中，篩選標記基因陽性個體，并以F為正向引物和R為反向引物，采用PCR鑒定和測序鑒定小黃魚生長激素與轉鐵蛋白融合基因插入家蠶基因中，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

（6）對G1代陽性個體，采用定性和定量檢測驗證小黃魚生長激素的表達水平，篩選建立小黃魚生長激素表達的生物反應器家系；

（7）對步驟（6）建立的生物反應器家系連續自交傳代4代，鑒定小黃魚生長激素與轉鐵蛋白融合基因在家蠶基因組中的遺傳穩定性和表達穩定性；

（8）建立小黃魚生長激素生物反應器家蠶品系：利用雜交、回交及人工飼料攝食性篩選的方法，將陽性家系基因組中的小黃魚生長激素基因導入家蠶皓月品系中，建立生物反應器家蠶品系。

2.如權利要求1所述的小黃魚生長激素生物反應器家蠶品系的構建方法，其特征在于所述步驟（1）中合成小黃魚生長激素與轉鐵蛋白融合基因具體為：利用小黃魚全基因組測序信息和小黃魚轉錄組信息，通過同源檢束方法，分別獲得小黃魚生長激素基因和轉鐵蛋白基因序列，設計小黃魚生長激素和轉鐵蛋白融合基因，根據家蠶密碼子偏好，優化并合成融合基因，并在融合基因前依次加上IE2啟動子序列、Kozak序列和真核生物磷酸轉運相關肽段的編碼序列，融合基因后加上6×His標簽編碼序列及SV40序列，最后在外源基因表達盒的兩端設置kpnⅠ和HindⅢ克隆位點，合成插入片段克隆到pUC57載體的Sma I Blunt位點，得到pUC57-PcGH-TF質粒。

3.如權利要求2所述的小黃魚生長激素生物反應器家蠶品系的構建方法，其特征在于所述步驟（2）中piggBAC載體pXL-Red與融合基因體外重組具體為：采用分別以限制性內切酶kpnⅠ和HindⅢ切割piggBAC載體pXL-Red及pUC57-PcGH-TF質粒，電泳分離得到載體片段和目的基因表達框片段，連接并轉化感受態細胞，挑斑，測序鑒定正確后，獲得piggBAC轉基因質粒pXL-Red-PcGH-TF。

4.如權利要求1所述的小黃魚生長激素生物反應器家蠶品系的構建方法，其特征在于所述步驟（3）中轉基因質粒pXL-Red-PcGH-TF導入家蠶受精卵具體為：以非滯育家蠶品系Nistari的新產受精卵為受體，將步驟（2）得到的piggBAC轉基因質粒pXL-Red-PcGH-TF稀釋至400ng/ul，以顯微注射方式導入15nl至家蠶受精卵中，在溫度25℃，濕度80%的條件下催青至孵化。

5.如權利要求1所述的小黃魚生長激素生物反應器家蠶品系的構建方法，其特征在于所述步驟（4）中獲得G1代蠶種具體為：蠶卵孵化后，按家蠶飼養程序飼養，上蔟結繭后，蛹期保護，羽化后自交制種獲得G1代。