[發(fā)明專利]一種球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010912928.2
• 申請日: 2020-09-03
• 公開（公告）號: CN111961682A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔巖;李珊山;宋洋;周俊峰
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)第一醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22;C07K16/14;C07K16/06
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 楊勝

本發(fā)明公開了一種球形孢子絲菌HSP70_1?8重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用，通過提取球形孢子絲菌總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增得到球形孢子絲菌熱休克蛋白70(HSP70)異構(gòu)體1?8基因全長序列，運用分子生物學(xué)方法進(jìn)行基因片段的體外重組并制備基因片段對應(yīng)的重組蛋白，將該重組蛋白應(yīng)用于家兔可制備出相應(yīng)的抗體，該抗體可用于制備對球形孢子絲菌感染早期快速診斷產(chǎn)品。本發(fā)明構(gòu)建了球形孢子絲菌HSP70_1?8重組蛋白原核表達(dá)體系，通過誘導(dǎo)可以快速大量表達(dá)；利用Ni親和層析柱一步完成純化，純化過程簡單快捷；免疫動物制備高效價多克隆抗體，所制備的抗體與目的蛋白具有良好的反應(yīng)特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組蛋白制備領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是由雙相型暗色真菌申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii sensu lato，下文簡稱Ss.)感染引起的最常見的深部真菌病。Ss.在環(huán)境中為菌絲相，寄生或腐生于植物或土壤中；而感染機(jī)體后，病灶中為酵母相。Ss.感染可形成難以自愈的慢性感染，不僅累及皮膚，也可通過淋巴管途徑感染臟器，發(fā)生播散的、系統(tǒng)的致命性感染。我國東北三省是該病全球流行最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。

早期人們認(rèn)為申克孢子絲菌為單一物種，但隨著研究的深入，Marimon等將Ss.確定為6個種的復(fù)合體，包括狹義申克孢子絲菌(S.schenckii sensu stricto)、球形孢子絲菌(S.globosa)、巴西孢子絲菌(S.brasilienis)、盧艾里孢子絲菌(S.luriei,formlynamed S.var.luriei)、墨西哥孢子絲菌(S.mexicana)和蒼白球孢子絲菌(S.pallida,synonymy S.albicans)，其中，球形孢子絲菌(呈全球性分布)、申克孢子絲菌(主要分布于美國、阿根廷、巴西、秘魯?shù)让乐迖?和巴西孢子絲菌(主要分布于巴西地區(qū))為常見致病菌。對于我國流行的菌株，絕大多數(shù)基因分型研究發(fā)現(xiàn)基本上均為球形孢子絲菌。

目前該病的診斷主要依靠皮膚組織病理檢查和真菌培養(yǎng)的聯(lián)合應(yīng)用。病理檢查需經(jīng)過標(biāo)本固定、包埋、制片、染色等數(shù)個耗時步驟，患者需等待5-7天，方可得到結(jié)果，然而如病理切片并未顯示星狀體、陽性孢子等典型的病理改變，尚無法診斷該病，則需聯(lián)合真菌培養(yǎng)進(jìn)行診斷。真菌培養(yǎng)同樣需以病變組織為樣品，而培養(yǎng)結(jié)果需等待7-14天，耗時更長，同時真菌生長受環(huán)境影響程度較大，當(dāng)環(huán)境溫度、濕度等各方面不適宜時，則不易生長，因此陽性率無法達(dá)到我們所需求的理想程度。另外，上述兩種方法均為有創(chuàng)檢查，術(shù)后傷口愈合會遺留疤痕，對于兒童患者及面部感染患者并非理想的檢測手段。如上所述，真菌培養(yǎng)和病理診斷均耗時較長，并且醫(yī)療機(jī)構(gòu)需具備較高的實驗條件和專業(yè)的技術(shù)人員，在基層醫(yī)院無法開展，只能憑借醫(yī)生的臨床經(jīng)驗予以治療。目前的研究表明，孢子絲菌感染人體或動物后，其抗原可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，此種抗原-抗體反應(yīng)可作為開發(fā)體外診斷試劑的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明旨在通過提取球形孢子絲菌總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增得到球形孢子絲菌熱休克蛋白70(HSP70)異構(gòu)體1-8基因全長序列，運用分子生物學(xué)方法進(jìn)行基因片段的體外重組并制備基因片段對應(yīng)的重組蛋白，將該重組蛋白應(yīng)用于家兔可制備出相應(yīng)的抗體，該抗體可用于制備對球形孢子絲菌感染早期快速診斷產(chǎn)品。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，本發(fā)明提供了一種球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法，其包括以下步驟：

S1：人工合成球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列，并在其中引入Nde I酶切位點、Hind III酶切位點、His標(biāo)簽和終止子；

S2：對S1中人工合成的球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列進(jìn)行驗證，以判斷合成的基因序列是否為預(yù)期序列；