[發(fā)明專利]一種球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010912928.2
• 申請(qǐng)日: 2020-09-03
• 公開（公告）號(hào): CN111961682A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔巖;李珊山;宋洋;周俊峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22;C07K16/14;C07K16/06
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 楊勝

1.一種球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：人工合成球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列，并在其中引入Nde I酶切位點(diǎn)、HindIII酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽和終止子；

S2：對(duì)S1中人工合成的球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列進(jìn)行驗(yàn)證，以判斷合成的基因序列是否為預(yù)期序列；

S3：將球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列與pET-30a質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒；

S4：對(duì)所述表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增；

S5：對(duì)S4擴(kuò)增后的質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

S6：對(duì)S5誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白。

2.如權(quán)利要求1所述的球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法，其特征在于，S2中對(duì)人工合成的球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列進(jìn)行驗(yàn)證的方法為：

以pUC57質(zhì)粒為載體，制得重組質(zhì)粒pUC57/HSP70_1-8；

于含有Amp的LB培養(yǎng)基的瓊脂平板挑取含質(zhì)粒pUC57/HSP70_1-8的DH5α單菌落，接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基，在37℃下200rpm培養(yǎng)過夜；按照全式金質(zhì)粒提取試劑盒的說明書操作提取質(zhì)粒；加入pH8.0的TE緩沖液溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度A值，計(jì)算質(zhì)粒濃度；對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系如下：

30℃酶切3h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用全式金凝膠回收試劑盒回收DNA片段；

根據(jù)球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為5’-CATATGGCACCCGCTGTAGGGA-3’；下游引物為5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’；對(duì)DNA片段擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確定人工合成的球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列是否為預(yù)期序列。

3.如權(quán)利要求1所述的球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法，其特征在于，S3中連接反應(yīng)具體為：

pET-30a質(zhì)粒經(jīng)Nde I和Hind III雙酶切回收載體片段，隨后與球形孢子絲菌HSP70_1-8基因序列進(jìn)行連接反應(yīng)，條件如下：

加水至終體積為25u1，混勻，16℃反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束加入乙酸鈉、冷無水乙醇，-20℃放置60min；離心收集沉淀，用70％的冷乙醇沉淀，真空干燥，TE緩沖液溶解，得到表達(dá)質(zhì)粒。

4.如權(quán)利要求1所述的球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法，其特征在于，S4中，對(duì)所述表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，具體為：

從37℃培養(yǎng)20h的LB平板中挑取大腸桿菌E.coli DH5α單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)入燒瓶中，于37℃，220rpm，震蕩培養(yǎng)3h；

隨后轉(zhuǎn)至用冰預(yù)冷的離心管中，置于冰上直至培養(yǎng)物冷卻到0℃；

4℃，4000rpm離心10min，回收細(xì)胞；

以冰預(yù)冷的CaCl₂重懸沉淀，置于冰上；取上述細(xì)胞，加入S3得到的表達(dá)質(zhì)粒，輕攪混勻，冰浴30min；42℃水浴90s，置冰浴上1min；加入LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)45min；取培養(yǎng)液涂布于含100μg/mL青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)；

挑取單個(gè)菌落接種于含100μg/mL青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩過夜；提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒。

5.如權(quán)利要求4所述的球形孢子絲菌HSP70_1-8重組蛋白的制備方法，其特征在于，S5中，對(duì)S4擴(kuò)增后的質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，具體為：

將經(jīng)過雙酶切鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株，制得帶有重組質(zhì)粒的宿主菌BL21；

挑取單菌落，接種于含Amp濃度100μg/mL，2×YT液體培養(yǎng)基中，200rpm 37℃培養(yǎng)至OD600為0.6；然后將帶有重組質(zhì)粒的宿主菌BL21，按1％的濃度接種2×YT培養(yǎng)基，Amp濃度100μg/mL；按上述方法擴(kuò)大培養(yǎng)至1L，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600為1.0，接IPTG至終濃度為0.8mM。