[發(fā)明專(zhuān)利]一種球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請(qǐng)日: 2020-09-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111978382B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李珊山;崔巖;姚蕾;周俊峰;尹煥才;田晶晶
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)第一醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/37
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/37;C12N15/62;C07K1/22;C12N15/70;C07K16/14
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 楊勝

本發(fā)明涉及一種球形孢子絲菌Gp70(Glycoprotein 70)重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用，通過(guò)提取球形孢子絲菌總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增得到球形孢子絲菌糖蛋白70(Gp70)基因全長(zhǎng)序列，運(yùn)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行基因片段的體外重組并制備基因片段對(duì)應(yīng)的重組蛋白，將該重組蛋白應(yīng)用于家兔可制備出相應(yīng)的抗體，該抗體可用于制備對(duì)球形孢子絲菌感染早期快速診斷產(chǎn)品。本案構(gòu)建了球形孢子絲菌Gp70重組蛋白原核表達(dá)體系，通過(guò)誘導(dǎo)可以快速大量表達(dá)；利用Ni親和層析柱一步完成純化，純化過(guò)程簡(jiǎn)單快捷；免疫動(dòng)物制備高效價(jià)多克隆抗體，所制備的抗體與目的蛋白具有良好的反應(yīng)特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組蛋白制備領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是由雙相型暗色真菌申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii sensu lato，下文簡(jiǎn)稱(chēng)Ss.)感染引起的最常見(jiàn)的深部真菌病。Ss.在環(huán)境中為菌絲相，寄生或腐生于植物或土壤中；而感染機(jī)體后，病灶中為酵母相。Ss.感染可形成難以自愈的慢性感染，不僅累及皮膚，也可通過(guò)淋巴管途徑感染臟器，發(fā)生播散的、系統(tǒng)的致命性感染。我國(guó)東北三省是該病全球流行最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。

早期人們認(rèn)為申克孢子絲菌為單一物種，但隨著研究的深入，Marimon等將Ss.確定為6個(gè)種的復(fù)合體，包括狹義申克孢子絲菌(S.schenckii sensu stricto)、球形孢子絲菌(S.globosa)、巴西孢子絲菌(S.brasilienis)、盧艾里孢子絲菌(S.luriei,formlynamed S.var.luriei)、墨西哥孢子絲菌(S.mexicana)和蒼白球孢子絲菌(S.pallida,synonymy S.albicans)，其中，球形孢子絲菌(呈全球性分布)、申克孢子絲菌(主要分布于美國(guó)、阿根廷、巴西、秘魯?shù)让乐迖?guó)家)和巴西孢子絲菌(主要分布于巴西地區(qū))為常見(jiàn)致病菌。對(duì)于我國(guó)流行的菌株，絕大多數(shù)基因分型研究發(fā)現(xiàn)基本上均為球形孢子絲菌。

目前該病的診斷主要依靠皮膚組織病理檢查和真菌培養(yǎng)的聯(lián)合應(yīng)用。病理檢查需經(jīng)過(guò)標(biāo)本固定、包埋、制片、染色等數(shù)個(gè)耗時(shí)步驟，患者需等待5-7天，方可得到結(jié)果，然而如病理切片并未顯示星狀體、陽(yáng)性孢子等典型的病理改變，尚無(wú)法診斷該病，則需聯(lián)合真菌培養(yǎng)進(jìn)行診斷。真菌培養(yǎng)同樣需以病變組織為樣品，而培養(yǎng)結(jié)果需等待7-14天，耗時(shí)更長(zhǎng)，同時(shí)真菌生長(zhǎng)受環(huán)境影響程度較大，當(dāng)環(huán)境溫度、濕度等各方面不適宜時(shí)，則不易生長(zhǎng)，因此陽(yáng)性率無(wú)法達(dá)到我們所需求的理想程度。另外，上述兩種方法均為有創(chuàng)檢查，術(shù)后傷口愈合會(huì)遺留疤痕，對(duì)于兒童患者及面部感染患者并非理想的檢測(cè)手段。如上所述，真菌培養(yǎng)和病理診斷均耗時(shí)較長(zhǎng)，并且醫(yī)療機(jī)構(gòu)需具備較高的實(shí)驗(yàn)條件和專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，在基層醫(yī)院無(wú)法開(kāi)展，只能憑借醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)予以治療。目前的研究表明，孢子絲菌感染人體或動(dòng)物后，其抗原可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，此種抗原-抗體反應(yīng)可作為開(kāi)發(fā)體外診斷試劑的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明旨在通過(guò)提取球形孢子絲菌總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增得到球形孢子絲菌糖蛋白70(Gp70)基因全長(zhǎng)序列，運(yùn)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行基因片段的體外重組并制備基因片段對(duì)應(yīng)的重組蛋白，將該重組蛋白應(yīng)用于家兔可制備出相應(yīng)的抗體，該抗體可用于制備對(duì)球形孢子絲菌感染早期快速診斷產(chǎn)品。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法，其包括以下步驟：

S1：人工合成球形孢子絲菌Gp70基因序列，并在其中引入Nde I酶切位點(diǎn)、HindIII酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽和終止子；

S2：對(duì)S1中人工合成的球形孢子絲菌Gp70基因序列進(jìn)行驗(yàn)證，以判斷合成的基因序列是否為預(yù)期序列；