[發(fā)明專利]一種球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010912909.X | 申請日： | 2020-09-03 |
| 公開（公告）號： | CN111978382B | 公開（公告）日： | 2022-03-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李珊山;崔巖;姚蕾;周俊峰;尹煥才;田晶晶 | 申請（專利權(quán)）人： | 吉林大學(xué)第一醫(yī)院 |
| 主分類號： | C07K14/37 | 分類號： | C07K14/37;C12N15/62;C07K1/22;C12N15/70;C07K16/14 |
| 代理公司： | 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369 | 代理人： | 楊勝 |
| 地址： | 130021*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 球形 孢子 gp70 重組 蛋白 制備 方法 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1：人工合成球形孢子絲菌Gp70基因序列，并在其中引入Nde I酶切位點、Hind III酶切位點、His標(biāo)簽和終止子；
S2：對S1中人工合成的球形孢子絲菌Gp70基因序列進(jìn)行驗證，以判斷合成的基因序列是否為預(yù)期序列；
S3：將球形孢子絲菌Gp70基因序列與pET-30a質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒；
S4：對所述表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增；
S5：對S4擴(kuò)增后的質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；
S6：對S5誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到球形孢子絲菌Gp70重組蛋白；
S2中對人工合成的球形孢子絲菌Gp70基因序列進(jìn)行驗證的方法為：
以pUC57質(zhì)粒為載體，制得重組質(zhì)粒pUC57/Gp70；
于含有Amp的LB培養(yǎng)基的瓊脂平板挑取含質(zhì)粒pUC57/Gp70的DH5α單菌落，接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基，在37℃下200 rpm培養(yǎng)過夜；按照全式金質(zhì)粒提取試劑盒的說明書操作提取質(zhì)粒；加入pH8.0的TE緩沖液溶解沉淀；紫外分光光度計測吸光度A值，計算質(zhì)粒濃度；對獲得的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系如下：
30℃ 酶切3 h，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用全式金凝膠回收試劑盒回收DNA片段；
根據(jù)球形孢子絲菌Gp70基因序列設(shè)計引物，上游引物為5’-CATATGGCTATATACGTAGCATCAAAC-3’；下游引物為5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’；對DNA片段擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定人工合成的球形孢子絲菌Gp70基因序列是否為預(yù)期序列；
所述球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的序列為：
MAIYVASNTANNAVVAVPIAENGSLLVAKGSSTATGGAGANGVSGGAPAGPDSLFSQSGVAIAGNYLFAVNAGSNTVTMLAIDKHNPAKLTVVGKSASLPGEFPTTVAASDKYKLVCVGLTGAKAGVACASYSAAGIGAVDALRPFNLGQTTPPAGPLNTVSQVFFSEDETTLYVTVKGDPTVSNTGFLAAFPVQNTRSSCHAAASVAASGVTSSPSGTAVLFGSSTIKGSSNLFVTDASFGAAVLSVDASGKASTVGKGVIAGQAATCWVAISPATKTAFVTDVGIDRLVEMSLEDASIIGSPIDLSASNGGVDPGLTDLRAAGSFVYALSPGNGTSDAAITVFNALTKQAVDHVSVASLGLTKSVEGMAILLHHHHHH。
2.如權(quán)利要求1所述的球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法，其特征在于，S3中連接反應(yīng)具體為：
pET-30a質(zhì)粒經(jīng)Nde I和Hind III雙酶切回收載體片段，隨后與球形孢子絲菌Gp70基因序列進(jìn)行連接反應(yīng)，條件如下：
加水至終體積為25 u1，混勻，16℃反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束加入乙酸鈉、冷無水乙醇，-20℃放置60min；離心收集沉淀，用70%的冷乙醇沉淀，真空干燥，TE緩沖液溶解，得到表達(dá)質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1所述的球形孢子絲菌Gp70重組蛋白的制備方法，其特征在于，S4中，對所述表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，具體為：
從37℃培養(yǎng)20h的LB平板中挑取大腸桿菌
隨后轉(zhuǎn)至用冰預(yù)冷的離心管中，置于冰上直至培養(yǎng)物冷卻到0℃；
4℃，4000rpm離心10min，回收細(xì)胞；
以冰預(yù)冷的CaCl2重懸沉淀，置于冰上；取上述細(xì)胞，加入S3得到的表達(dá)質(zhì)粒，輕攪混勻，冰浴30 min；42℃水浴90 s，置冰浴上1 min；加入LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)45min；取培養(yǎng)液涂布于含100 μg/mL青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)；
挑取單個菌落接種于含100 μg/mL青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200 rpm振蕩過夜；提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒。
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