[發(fā)明專(zhuān)利]一種針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)表達(dá)和純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010911659.8
• 申請(qǐng)日: 2020-09-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111961687A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張進(jìn);李健;萬(wàn)雙燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳晶蛋生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/866
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/866;C12N15/12;C12P21/02
• 代理公司: 新余市渝星知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 36124
• 代理人: 廖平

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)表達(dá)和純化方法。本發(fā)明提供了一種針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)表達(dá)和純化方法，包括如下步驟：將人全長(zhǎng)TRPM4基因片段克隆到pAntigen Mem載體，篩選陽(yáng)性克隆；提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10菌株，挑選陽(yáng)性克隆；抽提桿粒，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生P3桿狀病毒；將P3桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入HEK293S GnTI^?細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，收集純化藥物靶點(diǎn)。之后，根據(jù)針對(duì)高血壓的TRPM4藥物靶點(diǎn)，有利于相應(yīng)的特異性小分子抑制劑和相關(guān)抗體的設(shè)計(jì)，以用于高血壓等心血管疾病的治療。本申請(qǐng)所述的針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)表達(dá)和純化方法能生產(chǎn)具有正常生理活性，產(chǎn)量達(dá)毫克級(jí)別的針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)，促進(jìn)相應(yīng)的相關(guān)抗體研發(fā)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高血壓藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)表達(dá)和純化方法。

背景技術(shù)

心血管疾病(CVD)，如高血壓，中風(fēng)和冠狀動(dòng)脈疾病，是當(dāng)今世界上威脅人類(lèi)最嚴(yán)重的疾病之一，已成為一個(gè)日益迫切的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。其中，高血壓作為最常見(jiàn)的心血管疾病之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，抗高血壓藥物的臨床應(yīng)用也在不斷發(fā)展和更新。

臨床用于高血壓治療的藥物主要有鈣拮抗劑(CCB)、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)及利尿降壓藥等，這些藥物均有不同程度的毒副作用，存著在很大的應(yīng)用局限性。因此，我們亟需尋找針對(duì)高血壓新的藥物靶點(diǎn)，同時(shí)為開(kāi)發(fā)一種新型、靶點(diǎn)特異、選擇作用較強(qiáng)且副作用小的靶向藥物提供重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

TRPM4是Ca²⁺激活的非特異性的陽(yáng)離子通道，在心血管系統(tǒng)的許多細(xì)胞中均有表達(dá)，比如傳導(dǎo)通路的心臟細(xì)胞、動(dòng)脈和靜脈平滑肌細(xì)胞。人類(lèi)TRPM4的遺傳變異體與多種心臟病傳導(dǎo)障礙有關(guān)。研究表明，心肌肥大的高血壓大鼠的心臟中TRPM4過(guò)度表達(dá)，TRPM4基因缺陷型大鼠的血壓明顯低于正常大鼠。同時(shí)，TRP channel家族成員之間的同源性很低，該家族成員比其他藥物靶點(diǎn)中更容易地篩選出特異性的藥物，限制了潛在的脫靶效應(yīng)。因此，TRPM4通道是非常理想且極具潛力的新型抗高血壓藥物靶點(diǎn)。

為了解決現(xiàn)市面上的抗高血壓藥物缺乏特異性且副作用大的缺陷，針對(duì)高血壓的關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)TRPM4，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的特異性小分子抑制劑和相關(guān)的抗體，以用于高血壓等心血管相關(guān)疾病的治療，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)人使用pAntigen Mem載體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系和優(yōu)化的純化系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)表達(dá)和純化方法，能生產(chǎn)具有正常生理活性，產(chǎn)量達(dá)毫克級(jí)別的針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)，促進(jìn)相應(yīng)的相關(guān)抗體研發(fā)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種針對(duì)高血壓的藥物靶點(diǎn)表達(dá)和純化方法，包括如下步驟：將人全長(zhǎng)TRPM4基因片段克隆到pAntigen Mem載體，篩選陽(yáng)性克隆；提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化藥物靶點(diǎn)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10菌株，挑選陽(yáng)性克隆；抽提桿粒，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生P3桿狀病毒；將P3桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入HEK293S GnTI^-細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，收集純化藥物靶點(diǎn)。

所述人全長(zhǎng)TRPM4基因片段編碼第1-1214號(hào)氨基酸序列，其氨基酸序列如sequence No.1所示。

轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，HEK293S GnTI^-細(xì)胞密度為2.0-3.0×10⁶細(xì)胞/ml，P3桿狀病毒加入體積為細(xì)胞液的1/10。

細(xì)胞培養(yǎng)使用帶擋板的燒瓶。

轉(zhuǎn)導(dǎo)12-24h后，向細(xì)胞液中加入丁酸鈉至終濃度為10mM。

轉(zhuǎn)導(dǎo)12-24h后，細(xì)胞培養(yǎng)溫度降至30℃。

人全長(zhǎng)TRPM4基因片段編碼的Sequence No.1的蛋白作為高血壓的藥物靶點(diǎn)的應(yīng)用。