[發明專利]一種用于評估豬組蛋白修飾的富集結果的檢測方法

有效

• 申請號: 202010909415.6
• 申請日: 2020-09-02
• 公開（公告）號: CN112011625B
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 李澤卿;劉夢佳
• 申請（專利權）人: 武漢愛基百客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;G01N33/539
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 陳凱

本發明提出了一種用于評估豬組蛋白修飾的富集結果的檢測方法，使用豬組織樣本通過ChIP?seq方法富集與目的蛋白結合的DNA，再采用熒光定量QPCR方法進行定量檢測，并對其結果進行判定，其中，定量檢測結果的計算方法采用“ΔΔCt”法進行判斷，對結果進行判定為，陽性引物和陰性引物的有效沉淀富集倍數≥2，視為富集效果達標，陽性引物和陰性引物的有效沉淀富集倍數2，視為富集效果未達標；能夠特異性的檢測豬組蛋白修飾水平，并能夠有效的判定DNA區域富集效果，從而為ChIP?seq提供重要參考，大大節省了由于富集效果差造成測序結果差所帶來的時間和經濟成本，為開展豬的表觀基因組學研究提供有效途徑。

技術領域

本發明涉及ChIP-seq技術領域，尤其涉及一種用于評估豬組蛋白修飾的富集結果的檢測方法。

背景技術

脂肪沉積和肌肉生長是豬的最重要的經濟性狀之一，其直接影響豬肉品質的優劣及其經濟價值的高低。因此，通過遺傳學研究豬脂肪和肌肉組織的遺傳性狀是一門十分重要的課題。

其中，表觀遺傳學研究是繼遺傳學后新興發展起來的科學領域，是研究基因的核苷酸序列不發生改變的情況下，基因的可遺傳表達。組蛋白修飾則是表觀遺傳調控一個重要的調控方式，它可通過甲基化、乙?；揎椀确绞絹碚{控基因的表達。而H3K4ME3和H3K27ac是組蛋白修飾的重要表觀遺傳修飾，已經在酵母菌、果蠅、人細胞和小鼠細胞都有表達并參與調控基因的轉錄。但在豬脂肪沉積和肌肉生長的機制還很模糊。技術人員通過對不同組蛋白修飾在豬脂肪和肌肉組織變化進行研究，探索在豬不同組織中的表達模式，再以此為參照，來尋找特異性調控脂肪沉積和肌肉生長的基因，其應用在畜牧業上，可以促進豬的遺傳改良，而在醫學上能夠更好的解釋代謝綜合征的發病機制，有助于尋求更有效的防治措施，服務于農業生產以及醫學臨床等實際應用提供參考。

目前，組蛋白修飾調控圖譜研究中最重要的技術手段為染色質免疫共沉淀與二代測序技術結合起來的測序技術，即ChIP-Seq技術。這種技術首先利用特定組蛋白修飾抗體將此類組蛋白修飾結合的DNA區域富集，純化建庫后對此區域進行高通量測序。此技術被認為是全基因組范圍內研究組蛋白修飾最好的方法。

但是，ChIP技術研究的主要材料集中在模式動物的細胞或組織樣本，處理方法已經較為成熟，但在豬肌肉和脂肪組織的應用較少，特別是脂肪組織對前期處理要求高、破碎難度大、提取完整細胞核較困難、材料間的穩定性不是很好，這些因素制約著該項技術在豬組織中的應用。特別是ChIP-seq成本較高，如果不在之前做好有效質控，在大規模樣本富集后通過測序結果看實驗的成敗將會帶來很大的損失。

發明內容

有鑒于此，本發明提出了一種用于評估豬組蛋白修飾的富集結果的檢測方法。

本發明的技術方案是這樣實現的：本發明提供了一種用于評估豬組蛋白修飾的富集結果的檢測方法，使用豬組織樣本通過ChIP-seq方法富集與目的蛋白結合的DNA，再采用熒光定量QPCR方法進行定量檢測，并對其結果進行判定；

其中，定量檢測結果的計算方法采用“ΔΔCt”法進行判斷，其計算方法如下，

首先，進行實驗樣本免疫沉淀的標準化，其公式為，

ΔCt_{?[normalized?樣品沉淀]}?=?Ct?_{[樣品沉淀]}?-?(Ct_?[Input]?-?Log2?^{(Input?Dilution?Factor)})，

Input?Dilution?Factor(IDF)?=?(fraction?of?the?inputchromatin?saved)?-1；

然后，計算陽性引物和陰性引物的有效沉淀富集倍數，其公式為，