[發(fā)明專利]一種用于評(píng)估豬組蛋白修飾的富集結(jié)果的檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010909415.6
• 申請(qǐng)日: 2020-09-02
• 公開（公告）號(hào): CN112011625B
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李澤卿;劉夢佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢愛基百客生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;G01N33/539
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務(wù)所(普通合伙) 42247
• 代理人: 陳凱

1.一種用于評(píng)估豬組蛋白修飾的富集結(jié)果的檢測方法，其特征在于：使用豬組織樣本通過ChIP-seq方法富集與目的蛋白結(jié)合的DNA，再采用熒光定量QPCR方法進(jìn)行定量檢測，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行判定；

其中，所述定量檢測結(jié)果的計(jì)算方法采用“ΔΔCt”法進(jìn)行判斷，其計(jì)算方法如下，

首先，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)樣本免疫沉淀的標(biāo)準(zhǔn)化，其公式為，

ΔCt_{?[normalized?樣品沉淀]}?=?Ct?_{[樣品沉淀]}?-?(Ct_?[Input]?-?Log2?^{(Input?Dilution?Factor)})，

Input?Dilution?Factor(IDF)?=?(fraction?of?the?input

chromatin?saved)?-1；

然后，計(jì)算陽性引物和陰性引物的有效沉淀富集倍數(shù)，其公式為，

ΔΔCt?_{[ChIP陽性引物/?ChIP陰性引物]}?=?陽性引物ΔCt?_{[normalized?樣品沉淀]}?-?陰性引物?ΔCt_{[normalized?樣品沉淀]}，

Fold?Enrichment?=?2^?(-ΔΔCt?[ChIP陽性引物/?ChIP陰性引物])；

最后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定為，

陽性引物和陰性引物的有效沉淀富集倍數(shù)≥2，視為成功陽性沉淀富集，富集效果達(dá)標(biāo)；

陽性引物和陰性引物的有效沉淀富集倍數(shù)2，視為成功陰性沉淀富集，富集效果未達(dá)標(biāo)；

其中，陽性引物核苷酸序列為：

CATSPER2?PF：CGGAGACTGGGATAGCGAAC；

CATSPER2?PR：AAAGGTATCCCGTCCCGAGTAT；

陰性引物核苷酸序列為：

STRC?PF：ATCAGGTATTCTGTGGCTCG；

STRC?PR：ATTCTCACCTTGTGTGGGATAG；

其中，使用豬組織樣本通過ChIP-seq方法富集與目的蛋白結(jié)合的DNA時(shí)，包括以下步驟，

S1對(duì)豬組織樣本進(jìn)行甲醛交聯(lián)反應(yīng)，然后進(jìn)行甘氨酸冰上終止交聯(lián)，再離心獲得沉淀，并用PBS對(duì)沉淀進(jìn)行清洗；

S2獲得的組織細(xì)胞分別用細(xì)胞裂解液和核裂解液進(jìn)行裂解以獲取細(xì)胞核沉淀；

S3超聲打斷染色質(zhì)以獲得蛋白核酸復(fù)合物的小片段：

S4使用組蛋白修飾抗體與蛋白核酸復(fù)合物的小片段進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，所述組蛋白修飾抗體為H3K4Me3或H3K27AC抗體；

S5洗脫并純化富集的與目的蛋白結(jié)合的DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于評(píng)估豬組蛋白修飾的富集結(jié)果的檢測方法，其特征在于：所述步驟S2中，所述細(xì)胞裂解液包括10mM?HEPES、80mM?KCl、1%(v/v)?IGEPAL?CA-630和蛋白酶抑制劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于評(píng)估豬組蛋白修飾的富集結(jié)果的檢測方法，其特征在于：所述細(xì)胞裂解液的添加量為，每1g豬組織加入3mL細(xì)胞裂解液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于評(píng)估豬組蛋白修飾的富集結(jié)果的檢測方法，其特征在于：所述步驟S2中，所述核裂解液包括50mM?Tris-HCl，pH8.0、10mM?EDTA、1.5%(v/v)?SDS和蛋白酶抑制劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于評(píng)估豬組蛋白修飾的富集結(jié)果的檢測方法，其特征在于：所述步驟S3中，所述超聲條件為每次超聲30s，間隔30s，超聲循環(huán)10次。