[發明專利]一種針對卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T細胞及其制備方法

有效

• 申請號: 202010907918.X
• 申請日: 2020-09-02
• 公開（公告）號: CN111925990B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 陳立;賈明明;黎小珠;王旭
• 申請（專利權）人: 北京立康生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/24;C12N15/867;C12N7/01
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本發明公開了一種對卵巢癌的Anti?MUC16 CAR?T細胞，包括，Anti?MUC16的單鏈抗體的核酸序列、CD8跨膜區核酸序列，4?1BB胞內信號區核酸序列、CD3Z胞內信號區核酸序列、IL?12核酸序列。還提供了制備該細胞的方法，（1）Anti?MUC16 CAR嵌合抗原受體的載體合成；（2）病毒包裝及慢病毒滴度的測定；（3）Anti?MUC16 CAR?T細胞的制備；（4）Anti?MUC16 CAR?T細胞的功能檢測。其優點在于，本發明選取抗MUC16特異性跨膜區表位的抗體，結合目前CAR?T基因手段，制備出能夠特異性識別和殺傷卵巢腫瘤的T細胞，有希望為卵巢癌的治愈提供一個新的治療方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體為一種針對卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T細胞及其制備方法。

背景技術

卵巢癌是一種常見的惡性腫瘤，在全世界范圍內致死率較高，由于患者在前期沒有明顯臨床癥狀，臨床缺乏確定的檢驗手段，通常在確診時候腫瘤已經惡化，導致該疾病治療難度大、治愈率較低。MUC16是一種高分子量糖蛋白，是一種跨膜蛋白，目前有科學家認為MUC16是早期診斷卵巢癌的重要腫瘤指標，并廣泛應用于臨床。近來研究發現，MUC16的異常過表達與卵巢癌的不良預后和發生發展密切相關，MUC16通過與間皮素結合促進卵巢癌遠處轉移，并且通過抑制腫瘤細胞和免疫細胞形成免疫突觸幫助卵巢癌細胞實現免疫逃逸。從而MUC16在卵巢癌中的過表達促進腫瘤細胞的增殖、遷移和轉移，促進卵巢癌的發生發展。

嵌合抗原受體T細胞(Chimericantigen receptor T cell,簡稱：CAR-T)是目前免疫細胞治療技術常用方法之一，通過提取患者體內的T淋巴細胞，將T淋巴細胞在體外進行基因整合修飾，使T淋巴細胞帶有能識別腫瘤細胞并能同時激活T淋巴細胞的嵌合抗體，被改造培養的T細胞進行大量擴增并回輸到病人體內，改造的T細胞獲得特異性識別和殺傷腫瘤細胞的能力，精準的殺傷腫瘤細胞，最終達到清除腫瘤的效果。但修飾的T細胞可能會表現出過度的活性，導致一些臨床副作用和毒性。

如何能夠得到特異性識別和精準殺傷，盡量減少副作用和毒性。是本領域技術人員一致探索的方向。

發明內容

為解決現有技術中針對卵巢癌提供一種精準殺傷、盡量減少副作用和毒性的治療方法的問題，本發明公開了一種針對卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T細胞及其制備方法，實現的目的為本發明選取抗MUC16特異性跨膜區表位的抗體，結合目前CAR-T基因手段，制備出能夠特異性識別和殺傷卵巢腫瘤的T細胞，有希望為卵巢癌的治愈提供一個新的治療方法。

為了實現上述目的，本發明公開的技術方案為：本發明提供的一種針對卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T細胞，該細胞包括，Anti-MUC16的單鏈抗體的核酸序列、CD8跨膜區核酸序列，4-1BB胞內信號區核酸序列、CD3Z胞內信號區核酸序列、IL-12核酸序列，所述各核酸序列依次見SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

進一步的，本發明還提供了制備所述CAR-T細胞的方法，包括如下步驟：(1)Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受體的載體合成：編碼Anti-MUC16的單鏈抗體的核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.1，編碼CD8跨膜區核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.2，編碼4-1BB胞內信號區核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.3，編碼CD3Z胞內信號區核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.4，編碼IL-12核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.5，將scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12引進合成到慢病毒表達載體pCDH載體上，通過測序鑒定，從而完成對嵌合抗原受體慢病毒表達載體的構建；

(2)病毒包裝及慢病毒滴度的測定：