[發明專利]一種針對卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T細胞及其制備方法

有效

• 申請號: 202010907918.X
• 申請日: 2020-09-02
• 公開（公告）號: CN111925990B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 陳立;賈明明;黎小珠;王旭
• 申請（專利權）人: 北京立康生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/24;C12N15/867;C12N7/01
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1.一種針對卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T細胞，其特征在于，該細胞包括，Anti-MUC16的單鏈抗體的核酸序列、CD8跨膜區核酸序列，4-1BB胞內信號區核酸序列、CD3Z胞內信號區核酸序列、IL-12核酸序列，所述各核酸序列依次見SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；

所述CAR-T細胞的制備方法，包括如下步驟：

(1)Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受體的載體合成：編碼Anti-MUC16的單鏈抗體的核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.1，編碼CD8跨膜區核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.2，編碼4-1BB胞內信號區核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.3，編碼CD3Z胞內信號區核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.4，編碼IL-12核酸序列，編碼的該序列見SEQ ID NO.5，將scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12引進合成到慢病毒表達載體pCDH載體上，通過測序鑒定，從而完成對嵌合抗原受體慢病毒表達載體的構建；

(2)病毒包裝及慢病毒滴度的測定：

(2-1)慢病毒包裝：用含質量濃度為10％FBS的DMEM培養液培養慢病毒包裝所用的293T細胞處于對數生長期，將其用胰酶進行消化，重新接種于10cm的細胞培養皿，次日，細胞匯率度處于80％-90％，更換新鮮的完全培養基，含質量濃度為10％FBS的DMEM培養液，取含有scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12序列的pCDH-EF1-CAR-IL12穿梭質粒30 μ g 加入至0.5mL無血清DMEM中、取包裝質粒PG-p1-VSVG 6 μ g 、PG-p1-RRE 7.5 μ g 與PG-p1-REV 6 μ g 加入至0.5mL無血清DMEM中，混勻，室溫靜置5min，將兩管質粒稀釋液輕輕混勻，室溫靜置20min，將轉染混合物逐滴加入至細胞培養皿中，輕輕晃勻后，將293T細胞置于37度、C0₂培養箱靜置培養6小時，6小時后，細胞更換新鮮的的完全培養基，含質量濃度為10％FBS的DMEM培養液，將細胞置于37度、C0₂培養箱靜置培養48小時，第48小時，收取病毒細胞，離心力400g，離心5min，去除細胞及死細胞碎片，將上清液加入至截留量為100kd的超濾濃縮管中，對慢病毒上清進行濃縮，離心力4000g，4度離心30min，收取病毒濃縮液，分裝凍存于-80度超低溫冰箱；

(2-2)慢病毒滴度的測定：24孔板，每孔種10000個3T3細胞，加入含質量濃度為10％FBS的DMEM培養基1毫升，12小時后第一個孔加入500微升的病毒上清，然后三倍梯度往下稀釋，做5-6個梯度，3天后用流式細胞儀檢測，計算病毒滴度；

(3)Anti-MUC16 CAR-T細胞的制備：

(3-1)外周血單個核細胞的分離：抽取卵巢癌病人外周全血至肝素鈉真空采血管，將抗凝全血進行離心，2000g，室溫離心10min，去除自體血漿，細胞沉淀加入PBS+0.5％HSA進行稀釋到終體積20mL，充分混勻，將人外周血淋巴細胞分離管按800g，室溫離心1min，用25ml移液管吸取稀釋后血液，緩慢加到人外周血淋巴細胞分離管中，800g，4℃離心15min，分離PBMC，用10ml移液管吸取并棄去上層澄清的液體，之后緩慢將PBMC層轉入到新的50ml離心管內，補充PBS+0.5％HSA至50ml，混勻，400g，升5降5，4℃離心10min，清洗PBMC，棄上清，用10ml移液管吸取20ml PBS+質量濃度為0.5％HSA重懸細胞，吹打混勻，細胞計數后，400g，離心10min，加入凍存液，進行細胞凍存；

(3-2)取新鮮或復蘇過夜的PBMC細胞，使用anti-Human-CD3抗體對細胞進行表面染色，流式上機檢測，計算CD3+T淋巴細胞比例，獲得CD3+T淋巴細胞總數，使用CD3/CD28免疫磁珠與CD3+T淋巴細胞進行混合，數量比為磁珠：CD3+T淋巴細胞＝3:1，翻轉搖床上室溫反應30min，使用磁鐵去除上清懸液,加入2mL X-VIVO-15培養液，其中包含100U/mL的IL-2細胞因子，吹打混勻后，將細胞與磁珠結合物，同時加入細胞培養板中，置于37度培養箱培養；

(3-3)第二天，富集獲得的CD3+細胞進行計數，按每10⁵細胞數加入0.1mL慢病毒上清，補X-VIVO培養基，含100U/mL IL-2 400 μ l ，并加入終濃度為8 μ g /mL的polybrene至感染細胞孔，對細胞進行離心感染，1500g，30度，離心1.5小時，離心完畢后，將培養板置于CO₂培養箱培養5小時，然后補足X-VIVO培養基，含100U/mL IL-2至2mL，CO₂培養箱培養過夜，次日換液處理，后面根據細胞生長情況進行細胞計數與CAR-T細胞的功能檢測；

(4)Anti-MUC16 CAR-T細胞的功能檢測：Anti-MUC16 CAR-T細胞與蛋白結合能力的檢測：通過瞬時轉染pTT5-MUC16-Flag質粒至293T細胞，使得293T培養上清能分泌表達MUC16-Flag蛋白，培養上清經過濃縮、定量后，獲得MUC16-Flag蛋白粗品，分別取10⁵的CAR-T細胞與MOCK-T細胞，與MUC16-Flag蛋白粗品100 μ L 進行4度孵育30min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗細胞，400g，室溫離心5min，棄上清；加入2 μ L anti-Flag-APC流式抗體4度孵育15min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗細胞，400g，室溫離心5min，棄上清；加入200 μ L 含2％牛血清的PBS重懸細胞，流式上機檢測陽性CAR-T細胞的表達率。