[發明專利]一種可批量進行體外脫靶檢測及sgRNA篩選的方法

有效

• 申請號: 202010906645.7
• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN111979226B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 程歡歡;陳瑩;謝紅嫻;蘭凱;黃龍
• 申請（專利權）人: 廣州鼓潤醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 岳泉清

一種可批量進行體外脫靶檢測及sgRNA篩選的方法，涉及基因工程技術領域。本發明的目的是要解決現有sgRNA脫靶檢測方法每次只能檢測一條sgRNA是否脫靶，以及如何篩選切割效率高、脫靶低的sgRNA的問題。本發明提供一種高通量的sgRNA脫靶檢測方法，以sgRNA pool形式進行體外轉錄，能夠同時檢測成千上萬條sgRNA的在靶或脫靶情況；根據在靶reads數判斷切割效率，進而根據脫靶位點及脫靶reads數判斷脫靶效應的高低。本發明可獲得一種可批量進行體外脫靶檢測及sgRNA篩選的方法。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種可批量進行體外脫靶檢測及sgRNA篩選的方法。

背景技術

CRISPR-Cas9系統源自細菌及古生菌的獲得性免疫系統，由于操作簡單高效而成為一種強大的基因編輯工具。自2013年初發現CRISPR/Cas9在細胞內實現DNA精確編輯開始，近年來呈現井噴式發展。相對于ZFN、TALEN等基因編輯技術來說，其更加簡單、經濟、容易操作，令其成為迄今為止最為有效、低廉和容易的基因編輯方法，其在基因編輯(包括基因敲除、敲入、點突變)、基因治療(鐮狀細胞貧血HBB基因修復等)、活細胞成像(如Cas-FISH)、功能基因篩選(CRISPRi/a正負向篩選)、靶向捕獲(CRISPR-capture)等方面具有極重要的應用意義。但是，在其廣泛應用的背后，CRISPR/Cas9系統有一個致命的缺點——容易脫靶，即在預期靶點以外的位點上產生額外的DNA剪切或編輯。脫靶可引起非預期的基因突變，甚至導致癌變發生，限制了CRISPR基因編輯的臨床應用。

然而脫靶是CRISPR/Cas9系統應用于基因治療和常規應用的一大弊端。導致脫靶的發生主要有兩方面因素。第一是sgRNA序列的容錯性，即sgRNA不僅能與完全互補配對的靶點相結合并切割，同時也會與基因組上其他相似序列結合而發生切割，容錯性可高達8個堿基甚至更多；第二是Cas9蛋白的持續表達易造成對非靶標位點的切割。因此，無論是在CRISPR基因治療的臨床轉化，還是常規的實驗應用中，脫靶都是影響臨床治療效果和實驗結果可靠性的關鍵。而如何篩選出切割效率最高、脫靶反應最低的sgRNA是關鍵。另一方面，對于某些單基因遺傳疾病，突變位點位置固定，可用sgRNA數量有限，需要預先明確sgRNA的脫靶效應，盡可能的避免采用引起嚴重脫靶的sgRNA，而這些都依賴于脫靶檢測。

目前用于全基因組范圍的脫靶位點檢測技術大致分為三類：1.軟件預測+測序驗證，如利用Cas-OFF finder軟件預測sgRNA可能的脫靶，再進一步進行Sanger測序驗證；2.基于細胞轉染技術的脫靶檢測方法，包括GUIDE-seq、BLESS、HTGTS、DISCOVER-seq等；3.不依賴細胞技術，體外檢測的方法，包括Digenome-seq、SITE-seq和CIRCLE-seq。然而以上技術均存在一定的局限性：

1)軟件預測：早期的脫靶檢測技術是由軟件預測和測序組成(如Sanger測序、NGS測序、全外顯子組測序等)，該類技術是利用Cas-OFF finder等脫靶預測軟件先進行預測，獲得可能的脫靶位點，然后對預測的脫靶位點進行PCR擴增、測序，從而確定該位點是否發生脫靶突變。其原理是在獲知的脫靶位點基礎上進行測序，以確定哪些位點發生了編輯。該類技術存在的不足之處是通量低，而且存在明顯的偏向性。

2)體內脫靶檢測：基于細胞轉染技術的體內脫靶檢測方法對于不易轉染的細胞系缺乏可操作性。GUIDE-seq依賴供體序列dsODN整合入基因組，HTGTS依賴染色體易位，二者均受細胞系DNA修復特異性和時效性、目標位點特異性、細胞周期等因素的影響，同時因切割位點處dsODN未整合或未發生染色體易位而遺漏突變頻率低于0.1％的脫靶位點。DISCOVER-Seq利用ChIP-seq的手段檢測Cas酶切割后產生的DSB修復因子MRE11在切割位點的富集，從而獲取切割位點信息。但是由于Cas酶并不是在同一時間內切割不同位點，而是有時間先后順序，所以同一時間點MRE11因子富集的差異檢測結果并不能真實反映全部的切割位點。另外，由于細胞內本身存在不少的非Cas酶切割產生的DSB，這部分DSB也會成為檢測時的假陽性位點。