[發(fā)明專利]一種可批量進(jìn)行體外脫靶檢測及sgRNA篩選的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010906645.7
• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN111979226B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程歡歡;陳瑩;謝紅嫻;蘭凱;黃龍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州鼓潤醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 岳泉清

1.一種可批量進(jìn)行體外脫靶檢測及sgRNA篩選的方法，其特征在于該方法按以下步驟完成：

一、收集4×10⁶~8×10⁶個(gè)細(xì)胞至離心管，離心，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，再離心，棄去上清液，提取離心后固相物的細(xì)胞基因組DNA；

二、將步驟一提取的基因組DNA打斷成為300bp~700bp片段，然后以DNA純化磁珠進(jìn)行純化；

三、對步驟二純化的DNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾、加莖環(huán)結(jié)構(gòu)接頭，然后采用核酸外切酶處理，再使用ddNTP處理；

步驟三中ddNTP處理的反應(yīng)體系和程序：

10×Thermopol緩沖液	5μL
ddATP (10mM)	0.5μL
Therminator DNA聚合酶	0.5μL
酶切后的DNA	44μL
總體積	50μL

反應(yīng)程序：75℃，30min；然后用1×DNA純化磁珠純化，洗脫體積25μL，Qubit測量DNA濃度6.4ng/μL；

四、設(shè)計(jì)并合成sgRNA oligo文庫，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及體外轉(zhuǎn)錄，得到sgRNA pool；

五、采用Cas酶及步驟四得到的sgRNA pool對步驟三經(jīng)ddNTP處理后的DNA進(jìn)行體外切割；

六、對體外切割后的DNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾、加線性接頭，線性接頭的5’端帶有生物素修飾；

步驟六中采用ABclonal 快速DNA建庫試劑盒進(jìn)行DNA末端修復(fù)、加A尾、加線性接頭；DNA末端修復(fù)、加A尾的具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下：

步驟五處理后的 DNA	37μL
末端修復(fù)緩沖液	10μL
末端修復(fù)酶	3μL
總體積	50μL

反應(yīng)程序：20℃反應(yīng)30min；65℃反應(yīng)30min，得到末端修復(fù)混合物；

末端修復(fù)混合物	50μL
Ligase MM	16.5μL
退火的線性接頭(5μM)	8μL
Ligase Mix	3μL
總體積	77.5μL

反應(yīng)程序：22℃反應(yīng)1h，然后用1×DNA純化磁珠純化，洗脫體積41μL；

七、將鏈霉親和素磁珠重懸，然后加入1×Bind and wash buffer室溫旋轉(zhuǎn)混勻洗滌，離心，去除上清，重復(fù)洗滌、離心、去除上清3次，利用2×Bind and wash buffer重懸鏈霉親和素磁珠，然后加入步驟六切割處理后的DNA，室溫旋轉(zhuǎn)混勻，置于磁力架，去除上清，得到鏈霉親和素磁珠吸附的DNA；

八、利用USER酶處理鏈霉親和素磁珠吸附的DNA，切開接頭的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后以USER酶處理后的DNA為模版，進(jìn)行回收PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行索引PCR，得到待上機(jī)文庫，進(jìn)行文庫質(zhì)檢及測序；

九、文庫下機(jī)后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將生物信息學(xué)分析得到的各個(gè)脫靶位點(diǎn)與每個(gè)sgRNA進(jìn)行比對，得到每個(gè)sgRNA對應(yīng)的在靶reads和脫靶位點(diǎn)、個(gè)數(shù)及對應(yīng)reads信息。