[發(fā)明專利]一種核酸擴增后處于灰區(qū)樣本的確證方法

有效

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• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN112143780B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設計）人: 吳堅;陳艷菊;伍輝
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12M1/34;C12M1/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發(fā)明公開了一種核酸擴增后處于灰區(qū)樣本的確證方法。在檢測試劑管內加入試劑，將核酸擴增反應管放入核酸擴增反應管架中，蓋上密封蓋，卡盒主體和密封蓋形成密閉空間；再向下按壓密封蓋形成預密封；再繼續(xù)向下按壓密封蓋，刀片與核酸擴增反應管接觸，并割破核酸擴增反應管的底部，核酸擴增反應管內液體流出至檢測試劑管內并然后發(fā)生反應；光源照射觀察結果確證檢測；裝置包括卡盒主體、核酸擴增反應管架和密封蓋，卡盒主體包括外殼、刀架和刀片。本發(fā)明不改變現有的PCR擴增或是等溫核酸擴增操作的任何流程，能對灰區(qū)的檢測樣本確證檢測，灰區(qū)信號的確證靈敏度高、特異性好，整個確證過程時間短，成本低、操作簡單。

技術領域

本發(fā)明涉及了一種核酸擴增的檢測方法，尤其是涉及一種核酸擴增后處于灰區(qū)樣本的確證檢測方法，可避免灰區(qū)樣本重復檢測，防止氣溶膠污染，適用于核酸檢測領域，屬于醫(yī)學檢測、分析化學、食品檢測等領域。

背景技術

核酸是攜帶遺傳信息的載體，不同生物體的核酸序列具有特異性，因此通過核酸檢測可有效鑒別和檢測待測物質。當前核酸檢測技術已廣泛應用于食品安全檢測、臨床診斷、基因分型、分子克隆等各個方面。由于采集的待測樣本核酸濃度較低，常需要對核酸樣本進行擴增。根據擴增反應中是否需要熱循環(huán)，可將常見的核酸擴增技術分為變溫擴增技術和恒溫擴增技術。變溫擴增技術即聚合酶鏈式反應(PCR)。恒溫擴增技術包括核酸序列依賴性擴增(NASBA),環(huán)介導的等溫擴增(LAMP),滾環(huán)擴增(RCA),鏈置換擴增(SDA),依賴解旋酶的擴增(HAD)等。PCR需要反應的升降溫過程，需要精密的控溫儀器。恒溫擴增不需要反復的升降溫過程，但往往需要高溫預變性、設計復雜引物、其他酶的輔助作用，且對模板特異性要求高等。

擴增后的核酸產物需要進行檢測來判斷是否為目標產物，常見的檢測方法可分為終點檢測法和過程檢測法。終點檢測法是指擴增反應結束后，對擴增后的產物進行檢測，如利用凝膠電泳法觀察擴增后核酸的長度，利用濁度法肉眼觀察核酸的產量，利用試紙條判斷目標核酸的有無等。終點法包括擴增和檢測兩個過程，耗時較長且檢測精度較差，擴增后再開蓋檢測也容易形成氣溶膠污染，造成后續(xù)檢測的假陽性結果。實時檢測法是在核酸擴增的過程中加入DNA熒光染料，如SYBR Green，SYTO 9，Evagreen，或者Taqman探針。核酸在擴增過程中染料會嵌入DNA雙鏈。PCR擴增過程中聚合酶切割Taqman探針，Taqman探針兩端的熒光基團和淬滅基團分開，產生熒光信號。實時檢測法重現性較好，檢測過程更加方便，不需擴增后再次檢測，避免了擴增后開蓋檢測可能造成的擴增子污染。

由于實時熒光PCR靈敏度高、檢測限低、重現性好，因此常用在食品安全檢測、醫(yī)學診斷等方面，熒光定量PCR結果常根據Ct值來判斷樣本是否為陽性。以新冠病毒檢測為例，根據國家疾控中心推薦的判斷標準，若Ct值37，可報告為陽性，Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若重做結果Ct值40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。因此，往往將核酸擴增中Ct值處于一定數值的樣本稱為灰區(qū)樣本。一般人們將Ct值處于35到40之間的樣本稱為灰區(qū)樣本。

在實際中也可以根據具體試劑盒的性能對灰區(qū)樣本的判斷進行調整。但總的來說，處于灰區(qū)的樣本不能直接進行陰性、陽性的判定，常需要重新進行PCR擴增檢測，非常耗費人力、物力、財力，因此開發(fā)一種有效檢測PCR擴增后Ct值處于灰區(qū)的樣本將大大縮短判定樣本的時間，減輕實驗人員的工作量。

發(fā)明內容

為了解決背景技術中存在的問題，針對熒光定量PCR擴增后Ct值處于灰區(qū)的待測樣本，本發(fā)明提供一種用于熒光PCR擴增、等溫擴增后Ct值處于灰區(qū)的樣本的一種確證方法，可避免二次核酸擴增，提高檢測效率，同時，本發(fā)明也可用于以擴增時間長短來進行樣本陰陽性判斷的等溫核酸擴增方法。

本發(fā)明的技術方案和情況是：

現有技術具體需要一種檢測試劑和配套的密閉混合裝置，情況介紹如下：