[發明專利]用于人甲狀腺癌基因融合試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010902632.2
• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN112011615A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 王寶霞;胡春旭;高伙妮;何文天;包文靜
• 申請（專利權）人: 上海睿璟生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了分子生物技術領域的一種用于人甲狀腺癌基因融合試劑盒及檢測方法，本試劑盒采用多重PCR捕獲技術和NGS測序技術，用于定性檢測甲狀腺結節穿刺活檢細胞學不確定的新鮮組織樣本中CCC6?RET,NCOA4?RET，PAX8/PPARG,ETV6?NTRK3融合基因的多種變異，根據分子標簽確定了檢測閾值，通過本試劑盒融合位點的檢測，并結合臨床病理分析結果，可為甲狀腺癌的輔助診斷和治療提供幫助。

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域的一種用于人甲狀腺癌基因融合試劑盒及檢測方法。

背景技術

甲狀腺癌是人內分泌器官中最常見的腫瘤，約占人類全部惡性腫瘤的4％，近年來其發病率在中國和全世界正在穩步增長。甲狀腺癌，按病理類型可分為乳頭狀癌(PTC)、濾泡狀癌(FTC)、未分化癌(ATC) 和髓樣癌(MTC)。其中，PTC與FTC合稱為分化型甲狀腺癌(DTC)，約占甲狀腺癌的85％-90％。分化型甲狀腺癌(DTC)通常發展于甲狀腺結節。此類結節在人群中普遍發生，特別是隨著年齡的增長，發生率也伴隨上升。然而，大多數甲狀腺結節是良性的，臨床上需要準確和迅速地識別惡性結節，并通過手術切除。在甲狀腺結節的診斷方法中，超聲引導細針穿刺(FNA)加以細胞學檢查是一種常見的診斷方法(以下簡稱FNA細胞學檢查)，此套方法在大多數情況下能夠可靠的診斷癌癥或良性結節。然而，在大約25％的結節中，FNA細胞學檢查不能排除癌癥的存在，從而阻礙了臨床管理。此類剩余的、不能排除癌癥的結節落入由貝塞斯達(Bethesda)分類系統定義的III，IV和V類結節，預期癌癥風險分別為5-15％，20-30％和50-75％。這些結節中癌癥風險的不確定性使得許多人接受了診斷性手術，但這些手術在許多良性結節患者中可以避免。

近十年來，精準醫學飛速發展，通過前人的研究，我們對甲狀腺癌分子靶點和相關信號通路已經逐步深入了解。現已經證實甲狀腺癌是多種基因改變積累的結果，這些基因的改變是重要的診斷、預后和預測性生物標記物。如：乳頭狀癌(PTC)中最常見的突變是BRAF和RAS基因的點突變和RET/PTC重組，所有這些突變都能夠激活線粒體激活蛋白激酶(MAPK)通路從而加速癌癥的發生和發展；濾泡狀癌(FTC) 常含有RAS突變或PAX8/PPARγ重排。涉及PIK3CA/AKT信號通路 (PIK3CA，PTEN突變)、TP53、AKT1和CTNNB1基因的突變常發生在晚期和未分化癌(ATC)中；髓樣癌(MTC)常攜帶位于RET和RAS基因中的點突變。基于前人的研究結果，NCCN和ATA等指南及專家共識均指出基因檢測可輔助診斷甲狀腺結節的良惡性，對于FNA不能確定良惡性的結節患者，推薦進行基因檢測輔助鑒別。同時，基因檢測也可以輔助甲狀腺癌患者的預后評估以及用藥指導：如甲狀腺癌中 BRAF等基因突變可提示復發風險，輔助患者的分子分型及風險分層。多種藥物已被FDA批準用于甲狀腺癌，基因檢測可提示患者靶向藥物獲益。

BRAF、RAS、PIK3CA、PTEN、TP53、AKT1和CTNNB1等人甲狀腺相關基因的突變多為點突變或微小的indel，臨床上常以DNA為投入，使用qPCR方法進行檢測，由于DNA在臨床樣本中相對穩定，且提取量較大，維持現行臨床檢驗方法并不需要做過多優化。對于融合檢測，目前臨床上基因融合檢測的金標準是熒光原位雜交(FISH)。雖然FISH 敏感性高，但存在著：僅能檢測已知的某一種融合，樣本用量較大且特異性差。RNA核酸，由于直接體現了融合基因和融合伙伴基因的外顯子拼接情況，目前已經是融合基因臨床檢驗的首選材料，目前也陸續有公司基于RNA水平的外顯子拼接，使用RT-PCR法來檢測融合，常用的為ARMS-PCR和數字PCR，其優點為靈敏度高，特異性好，但其通量小，一次只能檢測幾種已知的融合。如果需要覆蓋甲狀腺癌常見的幾種融合類型，需要大量的RNA核酸，這和FNA組織的微小RNA量是相悖的。隨著高通量測序技術的快速發展，基于NGS技術檢測融合基因的方式也逐漸被應用且被接受。目前市場上基于二代測序平臺的檢測試劑盒常見的為基于DNA水平的探針捕獲法建庫，但成本高操作流程繁瑣；而RNA水平的逆轉錄加多重PCR技術，結合了qPCR的靈敏度和特異性以及NGS技術結果的直觀性，操作簡便，耗時短，只需一份樣本即可檢測所有融合類型，具有突出的方法學優勢。