[發明專利]一種增強樹突狀細胞抗原提呈能力的方法

有效

• 申請號: 202010902355.5
• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN111944755B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 張鵬;楊照宇;王元國;張金霞
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學總醫院
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0786;C12N5/09;C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了一種增強樹突狀細胞抗原提呈能力的方法，包括如下步驟：(1)制備高自噬水平胸腺瘤細胞：1)復蘇從液氮中保存胸腺瘤細胞系Thy0517 CGMCC No.9328，培養；2)從Thy0517中提取RNA并逆轉錄為cDNA，擴增Atg12基因片段并插入質粒載體pc3.1(+)中，得到重組質粒；將重組質粒轉染得到高自噬水平胸腺瘤細胞；(2)高效培養成熟樹突狀細胞；(3)高自噬水平胸腺瘤細胞和成熟樹突狀細胞共培養，得到抗原提呈能力增強的樹突狀細胞。本發明所用Thy0517細胞，培養條件簡單，易大量獲取，作為細胞原材料更加方便。本方法步驟簡單、技術難度低，成本低。

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種增強樹突狀細胞抗原提呈能力的方法。

背景技術

胸腺作為中樞淋巴器官，與機體的很多免疫功能密切相關，胸腺的病變往往會導致人體出現免疫方面的異常。目前已有研究證實，胸腺瘤微環境可提高樹突狀細胞自噬，進而增強樹突狀細胞的抗原提呈能力，從而在重癥肌無力等自身免疫性疾病的發生中發揮致病作用。因此，深入挖掘胸腺瘤合并重癥肌無力患者的樹突狀細胞自噬調控機制并從中產生新的發現可為免疫相關治療提供新的方法和思路。

目前國內外胸腺瘤相關免疫基礎研究相比于其他腫瘤少很多，主要原因之一在于胸腺瘤細胞系培育困難，目前國內外報道的僅有5例，且持續用于開展研究的僅2例。一例為2012年來自美國印第安納大學醫學院的學者發表的AB型胸腺瘤細胞系IU-TAB-1，另一例即為本申請的發明人于2015年創立的人AB型胸腺瘤細胞系Thy0517，并于2014年申請專利并于2016年獲得的專利權，專利號為ZL201410312866.6，此細胞系為國內罕見的可穩定傳代的人胸腺瘤細胞系，穩定的胸腺瘤細胞系是開展胸腺及相關微環境研究的瓶頸，同時也是進行各項胸腺瘤及免疫相關細胞實驗的基礎，但是迄今為止利用胸腺瘤細胞系制備免疫模型并提高特殊的免疫細胞亞群功能的發明尚未見報道。

樹突狀細胞是具有獨特功能的細胞，它可以將先天性和適應性免疫反應聯系起來。特別是目前它們被認為是最有效的抗原提呈細胞。樹突狀細胞的自噬與抗原提呈能力密切相關，目前研究認為樹突狀細胞的自噬增強其抗原提成能力亦隨之增強。但是樹突狀細胞的體外穩定培養具有較大的局限性和難度。目前國內外主流的方式主要有兩種，一種是通過直接分離人外周血獲得，但是這種方式采血量大、得率低、純度較差，難以滿足大規模體外實驗的需求。另一種方法是通過其他細胞系間接刺激得到，但是所需刺激因子眾多，受實驗環境等因素影響各因子的比例難以把握，刺激結果往往不理想且穩定性較差。

現有的研究和技術提高樹突狀細胞的抗原提呈能力主要是通過兩種方式。一種是通過直接突變多肽負載樹突狀細胞等抗原提呈細胞實現，另一種是將突變抗原導入樹突狀細胞。但是這些方法存在的缺點在于樹突狀細胞的抗原提呈能力提升有限而且效率較低。更為重要的是，直接對樹突狀細胞進行突變抗原負載或導入等操作時需在細胞膜上打孔，這樣容易對細胞本身的結構完整性造成損害影響細胞狀態，每次操作之后細胞往往會出現一定比例的死亡，不利于樹突狀細胞后續的進一步應用。還有報道指出可通過雷帕霉素刺激神經膠質細胞自噬，然后提取該細胞分泌的自噬小體，再利用提取的自噬小體刺激樹突狀細胞成熟從而增強樹突狀細胞對下游T細胞等的激活作用，但是細胞自噬小體的提取需超高速離心機，對設備的要求較高，且大量提取時自噬小體的純度難以把控。

因此，本領域迫切需要對現有提升樹突狀細胞抗原提呈能力的方案進行進一步完善和優化，從而獲得數量多、狀態好、高得率的抗原提呈能力增強的樹突狀細胞。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的缺陷與不足，提供一種增強樹突狀細胞抗原提呈能力的方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種增強樹突狀細胞抗原提呈能力的方法，包括如下步驟：

(1)制備高自噬水平胸腺瘤細胞：