[發(fā)明專利]一種增強樹突狀細胞抗原提呈能力的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010902355.5
• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN111944755B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設計）人: 張鵬;楊照宇;王元國;張金霞
• 申請（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學總醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0786;C12N5/09;C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種增強樹突狀細胞抗原提呈能力的方法，其特征是包括如下步驟：

（1） 制備高自噬水平胸腺瘤細胞：

1）復蘇從液氮中保存的胸腺瘤細胞系Thy0517 保藏編號為CGMCC No.9328，進行細胞培養(yǎng)；

2）從胸腺瘤細胞系Thy0517中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Atg12基因上、下游引物擴增Atg12基因片段并插入質(zhì)粒載體pc3.1（+）中，得到重組質(zhì)粒pc3.1（+）-Atg12；

所述Atg12基因上、下游引物分別用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述Atg12基因用SEQ ID NO.3所示；

3）將步驟2）獲得的重組質(zhì)粒pc3.1（+）-Atg12轉(zhuǎn)染胸腺瘤細胞系Thy0517，得到高自噬水平胸腺瘤細胞；

（2）高效培養(yǎng)成熟樹突狀細胞

1）復蘇從液氮中保存的人急性單核細胞白血病細胞THP-1，在THP-1專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到細胞達0.5×10⁶個/ml-2×10⁶個/ml的細胞懸液；

2）將所述人急性單核細胞白血病細胞THP-1細胞懸液鋪入6孔板，每孔1-2ml，加入1.5-6μl誘導樹突狀細胞成熟混合因子A，混勻，培養(yǎng)36-48h；

3）各孔用1×PBS清洗細胞，再向各孔中加入新鮮的THP-1專用培養(yǎng)基1-2mL，和8-30μl誘導樹突狀細胞成熟混合因子B，混勻，培養(yǎng)12-36h，得到成熟樹突狀細胞；

（3）高自噬水平胸腺瘤細胞和成熟樹突狀細胞共培養(yǎng)

將步驟（1）獲得的高自噬水平胸腺瘤細胞接種于Transwell細胞培養(yǎng)板的上層培養(yǎng)室，將步驟（2）獲得的成熟樹突狀細胞接種于Transwell細胞培養(yǎng)板的下層培養(yǎng)室，共培養(yǎng)1-3天，得到抗原提呈能力增強的樹突狀細胞；

所述誘導樹突狀細胞成熟混合因子A由終濃度150±50ng/μl的12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、終濃度60±20ng/μl的重組人白細胞介素-4、終濃度40±10ng/μl的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和余量為濃度50 mg/mL海藻糖PBS溶液組成，所述海藻糖PBS溶液的溶質(zhì)是D-海藻糖，溶劑是pH=7的滅菌1×PBS；

所述誘導樹突狀細胞成熟混合因子B由終濃度7±3ng/μl的細胞用脂多糖、終濃度7±3ng/μl的重組人白細胞介素-6，余量為濃度50 mg/mL的海藻糖PBS溶液組成，所述海藻糖PBS溶液的溶質(zhì)是D-海藻糖，溶劑是pH=7的滅菌1×PBS。