[發明專利]重組腺相關病毒顆粒及其應用

有效

• 申請號: 202010901859.5
• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN111808175B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 楊興林;賈國棟;楊佳麗;李琴;夏清梅
• 申請（專利權）人: 和元生物技術（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07K14/015
• 分類號: C07K14/015;C12N15/864;C12N5/10;A61K48/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中

本發明涉及基因工程領域，具體而言，涉及一種重組腺相關病毒顆粒及其應用。重組腺相關病毒顆粒包含變異的AAV6衣殼蛋白，該變異的6型腺相關病毒衣殼蛋白，其中相對于相應野生型AAV6衣殼蛋白，所述變異的AAV6衣殼蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位點介于野生型AAV6衣殼蛋白的第588和589位氨基酸之間。該重組腺相關病毒顆粒具有更強的感染能力，因而可以在更低的使用劑量下達到與常用劑量基本相同的感染效果，從而能有效降低在轉導過程中對宿主細胞的損傷。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體而言，涉及一種重組腺相關病毒顆粒及其應用。

背景技術

利用轉基因疾病模型進行人類疾病的研究由來已久，合適的轉基因動物疾病模型不僅僅為疾病發病機理的研究提供重要的基礎理論依據，而且避免了人體實驗的造成的風險和倫理問題。轉基因動物疾病模型的構建促進了人類對基因功能的了解和研究，同時促進了臨床經驗的積累和相應罕見病的藥物開發。

轉基因小鼠的構建一般策略是利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，此方法非常便利，但是依賴于價格高昂、操作精細的顯微注射設備及受過訓練經驗豐富的操作人員。目前關于通過腺相關病毒感染受精卵的相關研究非常有限，根據現有的文獻報道顯示，重組的腺相關病毒作為載體感染小鼠植入前胚胎制備轉基因小鼠的方法比傳統通過顯微注射技術的方法優勢在于操作簡便，效率更高，在宿主組織里能達到高水平的基因表達，除此之外，已被證實其在應用于人的基因治療方面有相對更低的基因毒性。

腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）是一類微小、無被膜及具有二十面體結構的病毒，它也是目前發現的一類結構最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒或皰疹病毒）來完成病毒包裝。由于其安全性好、宿主細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉移載體之一，在世界范圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。不同血清型的腺相關病毒在實驗動物中有不同的組織親和性。

AAV病毒，尤其是AAV6血清型，可以有效的感染受精卵。但是相對來說，文獻公開報道的AAV6使用的劑量比較大，通常在40ul受精卵培養基中加入（6～9）×10⁹ vg總量的病毒顆粒，才能達到有效的受精卵感染。由于AAV高劑量下會對受精卵存在一定毒性，隨著AAV使用劑量的增加，受精卵停止發育(死亡)的比例也會明顯增加，此外受精卵移植的存活率也會降低，6×10⁹ vg感染胚胎移植存活率大概18%，而6×10⁷ vg感染移植存活率能達到30%，所以有效降低AAV感染受精卵使用量，一方面節省成本，另一方面可以提高受精卵感染后的存活率以及胚胎移植后的存活率。

發明內容

本發明的第一方面涉及一種變異的AAV6（6型腺相關病毒）衣殼蛋白，其相對于相應野生型AAV6衣殼蛋白，所述變異的AAV6衣殼蛋白中插入有所述變異的AAV6衣殼蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位點介于野生型AAV6衣殼蛋白的第588和589位氨基酸之間。

本發明的第二方面涉及一種重組腺相關病毒顆粒，其包含如上所述的變異的AAV6衣殼蛋白。

本發明的第三方面涉及一種腺相關病毒載體系統，其包含用于編碼所述變異的AAV6衣殼蛋白的核酸片段。

本發明的第四方面涉及藥物組合物，其包含如上所述的重組腺相關病毒顆粒和/或如上所述的腺相關病毒載體系統，以及藥學上可接受的賦形劑。

本發明的第五方面涉及一種將目的基因產物遞送到受精卵或囊胚中的非治療目的方法，包括：

將如上所述的重組腺相關病毒顆粒以（6～9）×10⁹ vg/40μL的濃度與受精卵或囊胚接觸；

其中當所述受精卵或囊胚來源于人類時，其為自受精或核移植開始不超過14天的受精卵或囊胚。