[發(fā)明專利]一種單細(xì)胞內(nèi)原位qPCR方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010900980.6
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN114107449A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹東;張靜源;張寅
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發(fā)明公開了一種單細(xì)胞內(nèi)原位qPCR方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟：(1)將細(xì)胞消化，吹打成為單細(xì)胞懸液，去上清，將細(xì)胞沉淀重懸，加入甲醛溶液進(jìn)行固定，之后加入Triton溶液進(jìn)行打孔，去上清，將細(xì)胞沉淀重懸；(2)采用分子信標(biāo)探針進(jìn)行探針法RT?qPCR。本發(fā)明的qPCR方法能看到單個細(xì)胞層面表達(dá)量的差異；不用將細(xì)胞分為單個細(xì)胞，不裂解細(xì)胞，而是讓qPCR試劑和探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行qPCR反應(yīng)，方法簡便快捷易操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種單細(xì)胞內(nèi)原位qPCR方法。

背景技術(shù)

DNA、RNA和蛋白質(zhì)是定義生物的最基本要素。在生命過程中，DNA像一個藍(lán)圖規(guī)劃著生命的走向，RNA和蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)將藍(lán)圖中的規(guī)劃變?yōu)楝F(xiàn)實。在這個過程中，作為生命體最小單位的細(xì)胞，它的一切活動都離不開蛋白質(zhì)的參與，蛋白質(zhì)構(gòu)成了細(xì)胞膜、細(xì)胞器、以及細(xì)胞核。同時，細(xì)胞內(nèi)部的所有代謝活動都是由蛋白質(zhì)完成。RNA是負(fù)責(zé)連接蛋白質(zhì)與DNA的橋梁，它轉(zhuǎn)錄著DNA中的規(guī)劃，將它們翻譯表達(dá)為蛋白質(zhì)，起到了承上啟下的作用。但是并不是DNA中的一切規(guī)劃都會翻譯表達(dá)為蛋白質(zhì)，因此DNA與蛋白質(zhì)其實是間接聯(lián)系著，直接聯(lián)系二者的是RNA。因此在分子生物領(lǐng)域的檢測中，多數(shù)生命活動是否進(jìn)行以RNA和蛋白質(zhì)為準(zhǔn)。在檢測RNA的方法中，實時熒光定量PCR是最普遍、最準(zhǔn)確以及最受認(rèn)可的檢測方法。

實時熒光定量PCR(qPCR)是廣泛用于分子生物學(xué)領(lǐng)域的一種成熟技術(shù)，它是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。qPCR的技術(shù)原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。qPCR的主要檢測方法有兩種：一種是SYBGreen法，即在qPCR體系中使用SYBGreen熒光染料，此染料可以特異性滲入雙鏈DNA中并且發(fā)出熒光，當(dāng)此染料未滲入雙鏈DNA時，它不發(fā)出任何熒光，從而保證了當(dāng)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的雙鏈DNA增加時熒光信號也會同步對應(yīng)等量增加。此方法為qPCR中最常用的方法。另一種是Taqman探針法，即PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物形成完全同步。

無論是SYBGreen法還是Taqman探針法都需要將細(xì)胞內(nèi)的RNA提取出來，再進(jìn)行下一步的qPCR反應(yīng)然后來檢測細(xì)胞中的RNA多少。提取RNA需要大量細(xì)胞，因此只能檢測一群細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)RNA表達(dá)情況，但是實際在提取RNA的細(xì)胞群里，并不是每一個細(xì)胞的目標(biāo)RNA表達(dá)情況都是一樣的，單個細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)RNA的表達(dá)情況是很難在這些方法里面體現(xiàn)出來。因此對于檢測研究來說，如果在細(xì)胞群內(nèi)有些細(xì)胞目標(biāo)RNA表達(dá)的多，而有些細(xì)胞目標(biāo)RNA表達(dá)的少，總的提取RNA后分析可能根本看不出差異。當(dāng)目標(biāo)RNA表達(dá)多的細(xì)胞占比大的話，那總體來看這個細(xì)胞群內(nèi)的目標(biāo)RNA表達(dá)量就高些，相反，目標(biāo)RNA表達(dá)少的細(xì)胞占比大，這個細(xì)胞群內(nèi)目標(biāo)RNA表達(dá)量就低。因此，這樣只能看到一群細(xì)胞RNA表達(dá)量的方法，得出的結(jié)果其實比較籠統(tǒng)。目前，分子生物學(xué)領(lǐng)域研究都傾向于精細(xì)化，細(xì)化到單個細(xì)胞層面，希望能看到單個細(xì)胞層面出現(xiàn)的差異，比如現(xiàn)在的單細(xì)胞測序技術(shù)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡檢測技術(shù)等等。現(xiàn)在市面上也有單細(xì)胞qPCR技術(shù)，這些技術(shù)主要是將細(xì)胞分為單個的，然后將細(xì)胞包裹在油滴以及qPCR試劑內(nèi)，接著將細(xì)胞裂解后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，然后檢測目標(biāo)RNA的表達(dá)情況。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種單細(xì)胞內(nèi)原位qPCR方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種單細(xì)胞內(nèi)原位qPCR方法，包括如下步驟：