[發明專利]一種單細胞內原位qPCR方法

在審

• 申請號: 202010900980.6
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN114107449A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 尹東;張靜源;張寅
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種單細胞內原位qPCR方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)將細胞消化，吹打成為單細胞懸液，去上清，將細胞沉淀重懸，加入甲醛溶液進行固定，之后加入Triton溶液進行打孔，去上清，將細胞沉淀重懸；

(2)采用分子信標探針進行探針法RT-qPCR。

2.根據權利要求1所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的甲醛溶液在體系中的濃度為1％～4％；

步驟(1)中所述的Triton溶液在體系中的濃度為0.2％；

步驟(1)中所述的固定的時間為10min～15min；

步驟(1)中所述的打孔的時間為3min。

3.根據權利要求2所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的甲醛溶液在體系中的濃度為1％；

步驟(1)中所述的固定的時間為10min。

4.根據權利要求1所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的去上清采用的方式為4℃條件下500g離心3min；

步驟(1)中所述的甲醛溶液為體積比為1.33％的甲醛溶液；

步驟(1)中所述的Triton溶液為體積比5％±0.1％的Triton溶液。

5.根據權利要求1所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的消化采用胰酶，其用量根據培養細胞所使用的培養皿決定，胰酶覆蓋培養皿表面所有生長細胞的表面；

步驟(1)中所述的將細胞沉淀重懸采用溫度為0℃±4℃的0.01M、pH＝7.4的1×PBS；

步驟(1)中所述的甲醛溶液和Triton溶液為冰溶液，溫度為0℃±4℃。

6.根據權利要求1所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的探針法RT-qPCR采用一步法RT-qPCR試劑盒；

步驟(2)中所述的分子信標探針5'端修飾有熒光基團，3'端修飾有淬滅基團；

步驟(2)中所述的分子信標探針的用量按照其在體系中濃度為1～5μM配比。

7.根據權利要求6所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：

所述的熒光基團為FAM；

所述的淬滅基團為BHQ1；

步驟(2)中所述的分子信標探針的用量按照其在體系中濃度為1μM配比。

8.根據權利要求1所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：步驟(2)中所述的RT-qPCR使用的細胞的用量為10μLRT-qPCR體系中細胞的數量小于100000個。

9.根據權利要求8所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：所述的RT-qPCR使用的細胞的用量為10μL RT-qPCR體系中細胞的數量為1000-100000個。

10.根據權利要求9所述的單細胞內原位qPCR方法，其特征在于：所述的RT-qPCR使用的細胞的用量為10μL RT-qPCR體系中細胞的數量為1000-10000個。