[發明專利]一種重組畢赤酵母工程菌及在制備嘌呤中的應用

有效

• 申請號: 202010900606.6
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN112143662B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發明（設計）人: 魏春;趙理想;錢曉芬;汪釗;孫杰
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/24;C12P17/18;C12R1/84
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種重組畢赤酵母及在制備嘌呤中的應用，所述重組畢赤酵母工程菌是將SEQ ID NO.1所示基因Rihc?2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI導入宿主菌構建獲得的。本發明首次將腺苷水解酶在畢赤酵母中以分泌表達方式高效表達，并且組合應用了基因高拷貝、抗性可循環使用表達載體、HAC1和PDI基因導入等強化蛋白表達的策略，提高了重組酶的生產效率；本發明得到的菌株WC?5在5L發酵罐中采用補料分批高密度發酵方法，腺苷水解酶蛋白表達量為500mg/L。發酵液上清粗酶液可應用于腺苷及鳥苷的水解反應。

(一)技術領域

本發明涉及一種重組畢赤酵母工程菌及在制備嘌呤中的應用。

(二)背景技術

腺嘌呤和鳥嘌呤在醫藥工業上具有重要應用價值。腺嘌呤是核酸的組成成分，參與遺傳物質的合成，能促進白細胞增生，使白細胞數目增加，用于防治各種原因引起的白細胞減少癥，特別是用于腫瘤化學治療時引起的白細胞減少癥，也用于急性粒細胞減少癥，是生物體內不可或缺的一種化合物。另外，腺嘌呤也是很多藥物的中間體，可用于生產植物激素6-BA、維生素B4、阿德福韋醋等。鳥嘌呤是抗病毒藥阿昔洛韋和更昔洛韋合成的重要中間體，同時還可應用于臨床治療由免疫功能低下而引發的盲性巨細胞病毒性視網膜炎，此外還應用于器官移植、艾滋病以及惡性腫瘤的輔助治療。

由于腺嘌呤和鳥嘌呤具有如此廣泛的用途，近年來全世界的用量也正在不斷地擴大，因此開發一種綠色環保，經濟適用的腺嘌呤和鳥嘌呤工業化方法受到了廣大化學生物工作者的關注。

目前，生產腺嘌呤和鳥嘌呤的方法主要有天然產物提取和化學法合成。由于天然產物提取存在效率低下、成本高等缺點，因此，工業化生產主要是采用化學法，但是，化學法一般都存在步驟比較長、反應條件苛刻、對環境不友好等缺點。以腺嘌呤為例，中國專利CN102321086A公開的制備方法，以乙酰次黃嘌呤為初始原料，先與三氯氧膦在N，N一二甲基苯胺催化下發生氯代反應，再通過高溫高壓氨化、精制等步驟得到腺嘌呤。此方法的缺陷在于，需要使用能耐受高溫高壓的特殊反應設備，對設備要求比較高，并且有安全隱患。另外，此方法產生的三廢的量比較大，處理麻煩，對環境不友好。中國專利CN10288'7899A中公開的制備方法，以丙二酸二乙醋為初始原料與甲酰胺合成4，6一二羥基嘧啶，再通過硝化、氯代、氨化、還原、環合等步驟得到腺嘌呤。此方法的缺陷在于，反應步驟較多，原子經濟性比較差，工業化價值較低。中國專利CN101125854A中公開的制備方法，利用高溫液態水水解腺苷制備腺嘌呤，此方法的缺陷在于，水解腺苷需要在高溫下進行，生成的副產物D一核糖在高溫下容易變性而無法利用，非常不經濟。中國專利CN103923083A中公開的制備方法，以腺苷為底物通過醋醉乙酰化后得到乙酰腺嘌呤和四乙酰核糖，再通過堿解、中和得到腺嘌呤。雖然此方法主產物腺嘌呤和副產物四乙酰核糖都能以較高的收率得到，但是此工藝復雜并且產生的三廢較多。

鑒于此，目前函待提出一種反應步驟簡單、產量高、成本低、環保的制備腺嘌呤和鳥嘌呤的方法。酶法水解制備腺嘌呤和鳥嘌呤的工藝就具有這樣的優勢。

大腸桿菌表達系統是目前應用得最多、研究最成熟的基因工程表達系統，它最突出的優點是工藝簡單、產量高、周期短、生產成本低,因而廣泛用在工業酶的表達生產上。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達調控機制和蛋白加工修飾能力，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過程，其產物往往形成沒有活性的包涵體。例如，中國專利CN105802938A中公開的制備方法，用重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α中表達腺苷水解酶，將腺苷溶于水中，加入腺苷水解酶進行反應，得到腺嘌呤。腺苷水解酶在大腸桿菌中進行表達，雖然方法簡單，但是大腸桿菌表達的是胞內酶，細胞破碎成本高，且酶液中含有大量雜質，甚至含內毒素，不利于腺嘌呤、特別是食品和醫藥級腺嘌呤的分離純化。