[發明專利]一種重組畢赤酵母工程菌及在制備嘌呤中的應用

有效

• 申請號: 202010900606.6
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN112143662B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發明（設計）人: 魏春;趙理想;錢曉芬;汪釗;孫杰
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/24;C12P17/18;C12R1/84
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種重組畢赤酵母工程菌，其特征在于所述重組畢赤酵母工程菌是將SEQ ID NO.1所示基因Rihc-2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI導入宿主菌構建獲得的；所述宿主菌為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

2.如權利要求1所述重組畢赤酵母工程菌，其特征在于所述基因Rihc-2連接到質粒pPIC9K上，構建表達載體pPIC9K-Rihc-2，導入宿主菌。

3.如權利要求1所述重組畢赤酵母工程菌，其特征在于所述基因Hac1連接到載體pPICZC中，構建表達載體pPICZC-Hac1，導入宿主菌；所述基因PDI連接到載體pPICZC中，構建表達載體pPICZC-PDI，導入宿主菌；

所述載體pPICZC按如下方法構建：以F7質粒為模板，利用引物Cre-F和Cre-R擴增Tcre基因片段；以pPICZα質粒為模板，利用引物Ori-Paox-F和Paox-R擴增Pox基因片段，利用引物Cre-Taox-F和Taox-R擴增Taox基因片段，利用引物Taox反向-R和Zeo反向-F擴增基因片段pP，利用引物ori-F和ori-R擴增基因片段Ori；以pPIC9K質粒為模板，利用引物Zeo-His4-F和引物His4-R擴增HIS4基因片段；將上述Tcre基因片段、Pox基因片段、Taox基因片段、基因片段pP、基因片段Ori和HIS4基因片段共6個片段連接，獲得載體pPICZC；

4.如權利要求1所述重組畢赤酵母工程菌，其特征在于所述重組畢赤酵母工程菌按如下方法構建：將表達載體pPIC9K-Rihc-2電轉入宿主菌中，篩選得到單拷貝腺苷水解酶基因的工程菌，利用轉化后載體擴增方法獲得多拷貝腺苷水解酶基因的工程菌；再利用抗性可循環表達載體技術將Hac1基因和PDI基因整合進基因組，得到重組畢赤酵母工程菌。

5.一種權利要求1所述重組畢赤酵母在制備嘌呤中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述應用方法為：以重組畢赤酵母經發酵培養獲得的上清液濃縮后為催化劑，加入底物，以pH6.0-7.0的緩沖液為反應介質構成水解體系，在20-50℃下反應4～24h，反應液分離純化，獲得相應嘌呤；所述底物為腺苷或鳥苷。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述底物加入量以水解體系總體積計為100-500g/L。