[發明專利]一種單增李斯特菌的檢測方法

有效

• 申請號: 202010896650.4
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN112098389B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 孫大文;張翠云;黃倫杰;蒲洪彬;張道瑞
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;B82Y40/00;B82Y15/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 殷妹

本發明公開了一種單增李斯特菌的檢測方法。本發明利用納米銀籠作為基底，將其與已知濃度的單增李斯特菌標準樣品液混合、孵化后進行拉曼檢測，建立單增李斯特菌濃度?拉曼信號強度標準曲線，再將納米銀籠基底與實際待測樣品混合、孵化后進行拉曼檢測所得的拉曼信號強度與標準曲線對比，從而得到實際待測樣品中單增李斯特菌的含量。本發明結合空間限位效應和拉曼指紋光譜，實現對單增李斯特菌的快速特異性檢測。所述方法簡單，無需制備模板，環保無污染，制備的納米銀籠基底外殼和內壁均粗糙，極大增加了單增李斯特菌與基底的接觸面積，從而顯著提高了SERS檢測的效果。

技術領域

本發明屬于光譜檢測領域，具體涉及一種單增李斯特菌的檢測方法。

背景技術

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，簡稱單增李斯特菌，兼性厭氧，革蘭氏陽性菌，大小為(0.4-0.5)μm×(0.5-2)μm，廣泛存在于自然界中。單增李斯特氏菌導致的細菌性食物中毒主要是通過食用受污染的食物，例如乳制品，即食肉和海鮮以及蔬菜和水果而發生的，且污染主要發生在加工過程中。單增李斯特菌感染會導致胃腸道疾病，對于免疫功能低下的患者會導致腦部和血液感染，或導致孕婦出現胎兒并發癥。單增李斯特菌是一種會形成生物膜的嗜冷菌，對大多數消毒劑具有抵抗力。因此及時準確識別出食品中的單增李斯特菌的存在十分重要。

傳統的分離鑒定法成本較低，但是存在步驟繁瑣、容易出現假陰性的缺點，需要專業技術人員的操作，并且從富集、分離到鑒定需要3-5天。新興的微生物快速檢測技術，如聚合酶鏈式反應、酶聯免疫吸附法(ELISA)、疏水性柵格濾膜法技術、免疫磁性分離技術、電阻抗技術、生物發光技術、探針技術等，雖然比起傳統的分離鑒定方法需要的時間大為縮短，并且各有優勢，但是也各自存在一定的局限性，如需要耗時復雜的前期準備、需要熟練的專業操作能力、抗體制備過程復雜且不穩定、儀器設備龐大昂貴、檢測時間長等。

表面增強拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering)是一種高靈敏度、快速無損的檢測技術，無需樣品制備，可對微生物進行原位實時研究。銀具有很強的拉曼增強效應，因而被廣泛應用為拉曼增強基底。然而，在復雜基質中單一的銀納米粒子用于檢測時光譜變化大，靈敏度低，且無法特異性識別單增李斯特菌。

隨著科學技術的發展，特異標記法也有了進展，具體的做法是在納米粒子表面修飾目標識別片段(如抗體、適配體、小分子配體)以形成SERS標簽。此類SERS標簽可以特異性結合微生物，從而有超靈敏性、高定量能力等優點，但基底制備步驟復雜，需要復雜的化學修飾工藝，抗體、適配體昂貴且不穩定，而且還增加了成本和產生抗生素耐藥性的風險。例如，專利申請CN 106645090 A中，在表面修飾了拉曼報告分子的金納米顆粒的表面合成了一層SiO₂層，后又在其表面修飾了致病菌的抗體，以此作為拉曼信號探針，修飾了致病菌抗體的磁性納米粒子用于磁分離，需要復雜的制備步驟和較長的基底制備時間，從而導致了總分析時間的延長，且需要使用抗體。專利申請CN 110702662 A中，使用硼酸官能化的聚多巴胺涂層Au@Ag納米顆粒作為SERS標簽，修飾IgG的Fe₃O₄磁性納米顆粒用于磁性分離，可以對細菌實現靈敏的檢測，然而，基底制備步驟繁瑣，耗時費力，且仍需要抗體的使用。因此，尋求一種新的檢測思路，以實現單增李斯特菌的快速特異性檢測仍是一個大的挑戰。

發明內容

為解決現有技術的缺點和不足之處，本發明的目的在于提供一種單增李斯特菌的檢測方法，結合空間限位效應和拉曼指紋光譜，實現對單增李斯特菌的快速特異性檢測，無需以微生物的大小、形狀或者其代謝產物制備模板，也無需使用昂貴且不穩定的抗體及適配體。

本發明目的通過以下技術方案實現：

一種單增李斯特菌的檢測方法，包括以下步驟：