[發明專利]低毒力黃瓜花葉病毒載體、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202010896645.3
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN111979263A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 竺錫武;謝鋒華;吳娟;何麗華;陳友倩
• 申請（專利權）人: 湖南人文科技學院
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 長沙智勤知識產權代理事務所(普通合伙) 43254
• 代理人: 曾芳琴

本發明公開一種低毒力黃瓜花葉病毒載體、構建方法及應用，所述低毒力黃瓜花葉病毒載體包括2b基因序列缺失的pCB?CMVF209?no2b序列、以及連接至所述pCB?CMVF209?no2b序列中氨基酸編碼序列9?17aa，所述9?17aa的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列中至少27個連續的堿基。本發明提供的低毒力黃瓜花葉病毒載體可侵染普通栽培煙草為代表的寄主植物且不表現毒力癥狀。

技術領域

本發明涉及載體構建技術領域，具體涉及一種低毒力黃瓜花葉病毒載體、構建方法及應用。

背景技術

黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)寄主范圍廣泛，并且有多種株系，在不同種植物上產生嚴重程度不同的癥狀。現有技術中，已通過黃瓜花葉病毒開發出多個病毒表達載體。但現有的CMV病毒表達載體中，部分病毒載體僅可在個別物種的寄主植物上表達，對部分寄主物種植株不能系統侵染。例如：Matsuo K等、向志丹等開發了一種完全刪除2b基因序列的CMV載體，只能用于系統侵染本氏煙植株和擬南芥植株，對寄主植物不表現癥狀，但系統侵染普通栽培煙草(Nicotiana tabacum)植株病毒含量低甚至不能檢測到病毒。另外一些CMV病毒表達載體則對寄主物種的植株會產生毒力癥狀。程曉東等開發了一種缺失90個堿基的2b基因序列的CMV載體。WANG等開發了一種CMV載體保留2b蛋白80氨基酸的基因序列，但這兩個保留2b基因序列的CMV載體在接種普通栽培煙草后會產生毒力癥狀。

因此有必要提供一種新型的低毒力黃瓜花葉病毒載體，以解決上述技術問題。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種低毒力黃瓜花葉病毒載體、構建方法及應用，以解決現有黃瓜花葉病毒載體不能侵染普通栽培煙草且不表達毒力癥狀的技術問題。

為實現上述目的，本發明提出的低毒力黃瓜花葉病毒載體，所述低毒力黃瓜花葉病毒載體包括2b基因序列缺失的pCB-CMVF209-no2b序列、以及連接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的氨基酸編碼序列9-17aa，所述9-17aa的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列中至少*個連續的堿基。

優選地，所述低毒力黃瓜花葉病毒載體還包括多個連接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的多克隆酶切位點序列，所述多個多克隆酶切位點序列包括Mlu I、Spe I、Apa I、Sma I、Ava I、BamH I和Sac II中的至少一個以及Stu I。

本發明還提供了一種低毒力黃瓜花葉病毒載體的構建方法，包括：

步驟一、取原始pCB-CMVF209質粒，將含有氨基酸編碼序列9-17aa的引物對原始pCB-CMVF209質粒進行擴增，并對擴增產物進行酶切以使2b基因序列缺失，制備得到2b基因序列缺失且具有氨基酸編碼序列9-17aa的PCR產物的酶切產物；

步驟二、將含有多克隆酶切位點序列的引物對原始pCB-CMVF209質粒進行擴增，并以所述多克隆酶切位點序列對應的內切酶對擴增產物進行酶切，制備得到含有所述多克隆酶切位點序列的PCR產物的酶切產物；

步驟三、酶切原始pCB-CMVF209質粒，獲得大片段產物；

步驟四、取連接酶將所述步驟一中制備的酶切產物、所述步驟二中制備的酶切產物、以及所述步驟三中制備大片段產物連接，制備得到如上述的低毒力黃瓜花葉病毒載體。

優選地，所述步驟一包括：

取原始pCB-CMVF209質粒，以NcoIF引物和2aORF1R引物擴增，其中，所述NcoIF引物含有Nco I酶切位點序列，所述2aORF1R引物含有Stu I酶切位點序列和氨基酸編碼序列9-17aa；