[發明專利]低毒力黃瓜花葉病毒載體、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202010896645.3
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN111979263A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 竺錫武;謝鋒華;吳娟;何麗華;陳友倩
• 申請（專利權）人: 湖南人文科技學院
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 長沙智勤知識產權代理事務所(普通合伙) 43254
• 代理人: 曾芳琴

1.一種低毒力黃瓜花葉病毒載體，其特征在于，所述低毒力黃瓜花葉病毒載體包括2b基因序列缺失的pCB-CMVF209-no2b序列、以及連接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的氨基酸編碼序列9-17aa，所述9-17aa的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列中至少27個連續的堿基。

2.如權利要求1所述的低毒力黃瓜花葉病毒載體，其特征在于，所述低毒力黃瓜花葉病毒載體還包括多個連接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的多克隆酶切位點序列，所述多個多克隆酶切位點序列包括Mlu I、Spe I、Apa I、Sma I、Ava I、BamH I和Sac II中的至少一個以及Stu I。

3.一種低毒力黃瓜花葉病毒載體的構建方法，其特征在于，包括：

步驟一、取原始pCB-CMVF209質粒，將含有氨基酸編碼序列9-17aa的引物對原始pCB-CMVF209質粒進行擴增，并對擴增產物進行酶切以使2b基因序列缺失，制備得到2b基因序列缺失且具有氨基酸編碼序列9-17aa的PCR產物的酶切產物；

步驟二、將含有多克隆酶切位點序列的引物對原始pCB-CMVF209質粒進行擴增，并以所述多克隆酶切位點序列對應的內切酶對擴增產物進行酶切，制備得到含有所述多克隆酶切位點序列的PCR產物的酶切產物；

步驟三、酶切原始pCB-CMVF209質粒，獲得大片段產物；

步驟四、取連接酶將所述步驟一中制備的酶切產物、所述步驟二中制備的酶切產物、以及所述步驟三中制備大片段產物連接，制備得到如權利要求1或2所述的低毒力黃瓜花葉病毒載體。

4.如權利要求3所述的低毒力黃瓜花葉病毒載體的構建方法，其特征在于，所述步驟一包括：

取原始pCB-CMVF209質粒，以NcoIF引物和2aORF1R引物擴增，其中，所述NcoIF引物含有Nco I酶切位點序列，所述2aORF1R引物含有Stu I酶切位點序列和氨基酸編碼序列9-17aa；

將制備的擴增產物通過Nco I、Stu I酶進行酶切，純化，制備得到2b基因序列缺失且具有氨基酸編碼序列9-17aa的PCR產物的酶切產物。

5.如權利要求4所述的低毒力黃瓜花葉病毒載體的構建方法，其特征在于，所述NcoIF引物如SEQ ID NO.2所示，所述2aORF1R引物如SEQ ID NO.3所示或SEQ ID NO.4所示或SEQID NO.5所示。

6.如權利要求3所述的低毒力黃瓜花葉病毒載體的構建方法，其特征在于，所述步驟二包括：

將含有Mlu I、Spe I、Apa I、Sma I、Ava I、BamH I和Sac II中至少一個以及StuI多克隆酶切位點序列的正向引物和含有AvrII酶切位點序列的反向引物對原始pCB-CMVF209質粒進行擴增；

以Stu I酶和Avr II酶對擴增產物進行酶切，制備得到含有所述多克隆酶切位點序列的PCR產物的酶切產物。

7.如權利要求6所述的低毒力黃瓜花葉病毒載體的構建方法，其特征在于，所述步驟二中正向引物含有Stu I、Mlu I、BamH I多克隆酶切位點序列，所述步驟二中正向引物如SEQID NO.6所示，反向引物如SEQ ID NO.7所示。

8.如權利要求6所述的低毒力黃瓜花葉病毒載體的構建方法，其特征在于，所述步驟二中正向引物含有StuI、SpeI、ApaI、BamH I多克隆酶切位點序列，所述步驟二中正向引物如SEQ ID NO.8所示，反向引物如SEQ ID NO.9所示。